Detectie van invasieve pulmonale aspergillose bij hematologische maligniteit Patiënten met behulp van laterale-flow-technologie

1. Inzameling, opslag en voorbereiding van het serum en bronchoalveolaire lavagevloeistof Verzamelen serum van onbehandelde bloedmonsters doordat bloedstolling bij 4 ° C en opslaan serum als aliquots bij -20 ° C voorafgaande aan gebruik. Bronchoalveolaire lavage vloeistoffen (BAL) moet worden opgeslagen aliquots bij -20 ° C. Let op: Opslag van serum en BAL als aliquots het potentieel voor afbraak van het doelantigeen door herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van monsters tijdens de test herhaald beperkt. Ontdooi monsters en meng het serum en BAL monsters door vortexen en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 14.000 rpm. Voor routineonderzoek van humane serummonsters verdunnen serum 1:1 (v / v) met weefselkweekmedium (TCG). TCG uit RPMI-1640 medium, 10% (v / v) foetaal kalf serum, 1% (v / v) van 200 L-glutamine oplossing en natriumazide (0,02% w / v) als conserveermiddel. Het medium wordt bereid vooraf worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele maanden. Breng 100 ul van de diluted serum om de LFD. Voor menselijke BAL vloeistoffen, en voor BAL vloeistoffen uit dierlijke modellen, van toepassing 100 ul nette monster aan de LFD, zonder voorbehandeling. Voor serum van diermodellen verdund serum 1:2 (v / v) met fosfaat gebufferde zoutoplossing bevattende 4% (w / v) EDTA, hitte 3min in een kokend waterbad gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 14.000 rpm en toepassing 100 ul supernatant nette de toestel LFD. 2. Toepassing van serum en BAL aan de laterale-flow-apparaat Bewaar de laterale-flow-apparaten bij kamertemperatuur (23 ° C). Bij deze temperatuur inrichtingen stabiel gedurende 12 maanden. Verwijder de apparaten uit het zakken en leg ze op een vlakke ondergrond. Een steriele pipet van toepassing 100 ul voorbehandelde serum of als zodanig BAL monster het vrijkomen poort van de inrichting. Laat de assay uitgevoerd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, waarna de resultaten van de tests worden geregistreerd. Let op: Binnen enkele seconden de vloeistof zal zijn seen tot migratie door capillaire werking langs de nitrocellulose membraan in het kijkvenster. 3. Opnemen en interpreteren LFD resultaten De LFD bestaat uit een interne controle lijn (aangegeven met de letter C op het kunststof) en een test lijn (aangegeven met de letter T). De controle regel moet altijd, ongeacht van Aspergillus antigeen in het serum of BAL monster. Dit toont aan dat de test correct is uitgevoerd. Als de Aspergillus antigeen aanwezig is in het serum of BAL monster, zal de test lijn verschijnen ook binnen 15 minuten van het monster applicatie. Omdat de intensiteit van de test lijn is evenredig met de hoeveelheid van Aspergillus antigeen in het monster, de test lijn kan worden weergegeven als een zwak positief (+), een gematigd positief (+ +) of een sterk positief (+ + +) . Echter, een positieve controle lijn, ongeacht intensiteit zou de aanwezigheid van Aspergillus antigeen in het monster. In ee afwezigheid van Aspergillus antigeen worden geen testlijn verschijnen, en het resultaat wordt als negatief (-). 4. Representatieve resultaten Representatieve voorbeelden van negatieve zwak positief matige positief en sterke positieve LFD resultaten BAL en serummonsters worden in figuur 1. Resultaten van antigeen-positieve LFD tests (sterke en zwakke) of negatief LFD proeven met BAL vloeistoffen van acute myeloïde leukemie (AML) patiënten die gediagnosticeerd volgens EORTC / MSG diagnostische criteria worden getoond in Tabel 1. Inbegrepen in deze tabel zijn de bijbehorende klinische en mycologische (galactomannan en cultuur) gegevens en resultaten van een Aspergillus-specifieke PCR-test ontwikkeld aan de St. Bartholomews Ziekenhuis 8, voor elke patiënt. De diagnose van de ziekte is gebaseerd op gastheer factoren (neutropenie, langdurig gebruik van corticosteroïden, de behandeling met andere erkende T-cel immunosuppressants), klinische criteria en GM positiviteit voor de BAL (hier gedefinieerd als een GM-index waarde> 0,8). Onder de 2002 EORTC / MSG richtlijnen 10, patiënten van 12, 13 en 16 werden gediagnosticeerd met 'mogelijk' IA op basis van de gastheer factoren en klinische criteria of GM positiviteit. Volgens de herziene (2008) EORTC / MSG richtsnoeren 2, gastheer factoren en GM positiviteit alleen of gastheer factoren en klinische criteria alleen niet geven 'mogelijk' invasieve schimmelinfectie, tenzij vergezeld van bewijsstukken van de klinische gegevens en mycologie respectievelijk. Patiënt 6 werd gediagnosticeerd met 'waarschijnlijk' IA onder zowel 2002 en 2008 richtlijnen als gevolg van gastheer factoren, grote en kleine klinische kenmerken en GM positiviteit. Let op, dat terwijl noch de LFD of PCR-testen worden op dit moment opgenomen in EORTC / MSG richtlijnen, is er een sterke overeenkomst tussen de twee assays en de commerciële galactomannan-test wijst op de aanwezigheid van Aspergillus antigeen en nucleïnezuur in de BAL-monster s patiënten 6 en 12. Bijkomende resultaten van de proeven tonen de effectiviteit van de LFD en PCR assays diagnose IPA vindt in Johnson et al. 8. Figuur 1. Negatieve (controle lijn) en positieve (controle en test lijn) resultaten van LFD tests met het serum en BAL. De intensiteit van de testlijn reacties zijn evenredig met de concentraties van de doel-antigeen in het serum en BAL monsters. Reacties typisch variëren van zwak (+) door matig (+ +) aan sterke (+ + +). Ongeacht testlijn intensiteit zou drie serum positieve reacties vermeld invasieve pulmonale ziekte aspergillose door de aanwezigheid van circulerende Aspergillus antigeen in de bloedstroom. Positieve BAL reacties (zwak, matig of sterk) zou wijzen op ontkieming van sporen en de ontwikkeling van potentieel pathogene hyfen in de longen. pdflinebreak "> Patiënt niet. PatiENT informatie Klinische criteria 1 BAL cultuur 2 GM MER-index 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 Aspergillus PCR-resultaat LFD resultaat 6 – Major CT tekenen (nodule en halo) en een kleine Negatief 0,9 (positief) Waarschijnlijk Waarschijnlijk Positief Zwak positief (+) 12 Verondersteld vorige schimmelinfectie Geen grote, een kleine Candida glabrata 6,43 (sterk positief) Mogelijk Geen Positief Sterk positief (+ + +) 13 Coagulase-negatieve stafylokokylococcus en E. coli in bloed Geen grote, twee kleine Negatief 0,25 (negatief) Mogelijk Geen Negatief Negatieve (-) 16 Borst infectie 3 minder belangrijke criteria, waaronder nieuwe infiltreren plus meervoud effusie Negatief 0,16 (negatief) Mogelijk Geen Negatief Negatieve (-) 1 knobbeltjes of halo's op een CT-scan is suggestief voor schimmelinfectie 2 Candida glabrata in BAL-vloeistof zou worden beschouwd als zijnde een verontreiniging als het is de tweede meest voorkomende geïsoleerde gist, als onderdeel van de normale menselijke flora 9 3 Een index van> 0,8 in de GM EIA-test van de BAL is een indicatie van Aspergillus-infectie 4 Gebaseerd op de 2002 EORTC / MSG diagnostische criteria voor 'mogelijk te bedienene ',' waarschijnlijk 'of' bewezen 'invasieve schimmelziekte 10 5 Op basis van de herziene (2008) EORTC / MSG diagnostische criteria voor 'mogelijk', 'waarschijnlijk' of 'bewezen' invasieve schimmelziekte 2 Tabel 1. Resultaten van LFD tests van BAL monsters van acute myeloïde leukemie patiënten met een waarschijnlijke IPA en van de controle AML patiënten (geen bewijs van infectie), en de EORTC / MSG diagnose van de infectie.