Обнаружение инвазивный легочный аспергиллез в гематологических больных злокачественных новообразований с помощью бокового потока технологии

1. Сбора, хранения и подготовки сыворотки и жидкости бронхоальвеолярного лаважа Сбор сыворотки из необработанных образцов крови, позволяя крови сворачиваться при температуре 4 ° С, и хранить сыворотку в качестве аликвоты при -20 ° C до использования. Бронхоальвеолярного лаважа жидкости (БАЛ), также должны быть сохранены как аликвоты при -20 ° C. Примечание: Хранение сыворотке и БАЛ как аликвоты ограничивает возможности деградации целевого антигена повторного замораживания-оттаивания образцов во время повторного тестирования. Оттепель образцов и смешивать в сыворотке и БАЛ образцы тщательно встряхивая и центрифуги в течение 1 мин при 14000 оборотах в минуту. Для обычного человека тестирование образцов сыворотки, разбавленной сыворотки 1:1 (объем / объем) с тканевой культурой среды (TCM). TCM состоит из RPMI-1640, 10% (объем / объем) эмбриональной телячьей сыворотки, 1% (объем / объем) 200 мм L-глютамин решение, и азид натрия (0,02% вес / объем) в качестве консерванта. Среда готовится заранее и может храниться при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Применяют по 100 мкл dilutред сыворотки LFD. Для человека BAL жидкости, так и для BAL жидкости из животных, применяют по 100 мкл образца аккуратным LFD, без предварительной обработки. Для сыворотки животных, разведите сыворотку 1:2 (объем / объем) с фосфатным буферным раствором, содержащий 4% (вес / объем) ЭДТА, тепла для 3 минуты в кипящей водяной бане, центрифуги в течение 5 мин при 14000 оборотах в минуту, и применять 100 мкл надосадочной аккуратно, чтобы LFD устройства. 2. Применение сыворотки и BAL на боковой поток устройств Хранить боковой поток устройств при комнатной температуре (23 ° C). При этой температуре, устройства стабильны в течение 12 месяцев. Удаление устройства из сумки и место на ровной поверхности. Используя стерильный наконечник пипетки, применяются 100 мкл предварительно обработанной сыворотке или БАЛ аккуратный образца выпуска порту устройства. Дайте анализ запустить в течение 15 мин при комнатной температуре, после чего результаты испытаний должны регистрироваться. Примечание: В течение нескольких секунд жидкость будет таковойан мигрировать под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозные мембраны в смотровое окно. 3. Учет и интерпретация результатов LFD LFD состоит из внутренней линии контроля (обозначается буквой С на пластиковый корпус) и тестовой линии (обозначается буквой Т). Контрольная полоска должна всегда появляются независимо от антигена Aspergillus в сыворотке или БАЛ образца. Это показывает, что анализ был работать правильно. Если антиген Aspergillus присутствуют в сыворотке или БАЛ образца, испытание линии также появятся в 15 минут в пример приложения. Поскольку интенсивность тест линии пропорциональна количеству антигена Aspergillus в образце, тестовая линия может появиться как слабый положительный (+), умеренная положительная (+ +) или как сильный положительный (+ + +) . Тем не менее, любой положительный тест линии, независимо от интенсивности, что указывает на наличие антигена Aspergillus в образце. В йэлектронной отсутствие антигена Aspergillus, ни один тест не появится строка, а результат записывается в виде отрицательной (-). 4. Представитель Результаты Типичные примеры отрицательные, слабая положительная, умеренная положительная, и сильные положительные результаты с LFD БАЛ и сыворотке крови показано на рисунке 1. Результаты антиген-положительных LFD тестов (слабое и сильное) или отрицательным LFD тестов с использованием BAL жидкости от острой миелоидной лейкемией (ОМЛ) пациентов, диагностированных по EORTC / MSG диагностические критерии приведены в таблице 1. В эту таблицу соответствующие клинические и микологические (галактоманнана и культуры) данные, и результаты Aspergillus-ПЦР тест, разработанный в Санкт-Bartholomews больницу 8, для каждого пациента. Диагностика заболевания основывается на множество факторов (нейтропения, длительное применение кортикостероидов, лечение с другими признанными Т-клеток immunosuppressants), клинические критерии и GM положительности для BAL (здесь определяется как значение индекса GM> 0,8). В 2002 году EORTC / MSG принципов 10 пациентов 12, 13 и 16 с диагнозом "возможно" И.А. на основе факторов хозяина и клинические критерии или GM положительности. В соответствии с пересмотренным (2008) EORTC / MSG принципы 2, факторы хозяина и GM положительности в одиночку или хозяин факторов и клинических критериев сам по себе не будет означать "возможно" инвазивной грибковой инфекции без сопровождения доказательств из клинических данных и микологии соответственно. Пациент 6 был поставлен диагноз «вероятные» И.А. в 2002 и 2008, потому что принципы принимающей факторов, больших и малых клинических признаков и GM положительности. Отметим, что в то время как ни LFD ни ПЦР в настоящее время включены в EORTC / MSG принципы, есть сильное соглашение между двумя анализов и коммерческих тест галактоманнана указывающие на наличие антигена Aspergillus и нуклеиновых кислот в BAL образец пациентов с 6 до 12 лет. Дополнительные результаты исследования демонстрируют эффективность LFD и ПЦР в диагностике МПА могут быть найдены в Джонсон и др. 8. Рисунок 1. Отрицательный (контроль линий) и положительного (контроль и тест линии) результатов LFD тесты с использованием сыворотки крови и БАЛ. Интенсивность реакции тестовой линии пропорциональна концентрации антигена-мишени в сыворотке и БАЛ образцов. Реакция обычно колеблется от слабой (+) по умеренной (+ +) сильным (+ + +). Независимо от того, тест интенсивности линии, все три сыворотки положительных реакций будет означать инвазивных заболеваний легких аспергиллез в связи с наличием циркулирующих Aspergillus антигена в крови. Положительная реакция БАЛ (слабая, умеренная или сильная) будет означать прорастание спор и развитие потенциально патогенных гифы в легких. pdflinebreak "> Пациент нет. ПатиЛОР-информация Клинические критерии 1 BAL культуры 2 GM ОВОС индекса 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 Aspergillus ПЦР результат LFD результат 6 – Основные признаки CT (узелок и гало) и один несовершеннолетний Отрицательный 0,9 (положительный) Вероятный Вероятный Положительный Слабый положительный (+) 12 Предполагаемые предыдущие грибковые инфекции Никаких серьезных, один несовершеннолетний Candida glabrata 6,43 (сильный положительный) Возможное Никто Положительный Сильная положительная (+ + +) 13 Коагулазонегативные Staphylococcus и Е. палочки в крови Никаких серьезных, два небольших Отрицательный 0.25 (отрицательный) Возможное Никто Отрицательный Отрицательный (-) 16 Инфекция грудной клетки 3 мелких критериев, включая новый проникнуть плюс множественного выпот Отрицательный 0.16 (отрицательный) Возможное Никто Отрицательный Отрицательный (-) 1 Узлы или ореолов на компьютерной томографии это свидетельствует о грибковой инфекции 2 Candida glabrata в БАЛ будет рассматриваться в качестве загрязнителя, так как это второй наиболее распространенной дрожжи изолированы как часть нормальной человеческой флоры 9 3 индекс> 0,8 в тесте GM ОВОС БАЛ свидетельствует о Aspergillus инфекции 4 На основании 2002 EORTC / MSG диагностических критериев "possiblе ',' вероятно 'или' проверенные 'инвазивных грибковых заболеваний 10 5 На основе пересмотренных (2008) EORTC / MSG диагностические критерии для «возможного», «вероятные» и «проверенных» инвазивных грибковых заболеваний 2 Таблица 1. Результаты испытаний LFD БАЛ образцы острой миелоидной лейкемией пациентов с вероятным МПА и от контроля больных ОМЛ (без признаков инфекции) и EORTC / MSG диагностики инфекции.