Eine schnelle und genaue Point-of-Care-Test für invasiver pulmonaler Aspergillose wird vorgestellt. Es nutzt die Vorteile der Lateral-Flow-Technologie unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörper, der an ein bindet<em> Aspergillus</em> Antigen bei Infektionen der Lunge ausgeschieden. Der Assay ist kompatibel mit Serum und brochoalveolar Lavage und stellt einen neuartigen Zusatz-Test zur Diagnose von Krankheitsbildern.
Invasive pulmonale Aspergillose (IPA) ist eine führende Ursache für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit hämatologischen Malignomen und hämatopoetischen Stammzelltransplantation Empfänger ein. Erkennung von IPA stellt eine beeindruckende diagnostische Herausforderung und, in Ermangelung eines "Goldstandard", beruht auf einer Kombination von klinischen Daten und der Mikrobiologie und Histopathologie wo dies möglich ist. Die Diagnose der IPA sind an die Europäische Organisation für Forschung und Behandlung von Krebs und dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mykologie Study Group (EORTC / MSG) Konsens zur Definition der "bewährten", "wahrscheinlich" und "möglich", invasive Pilzkrankheiten 2 entsprechen . Derzeit sind keine Nucleinsäure-basierten Tests wurden auf äußere IPA Detektion und so Polymerase-Kettenreaktion (PCR) validiert ist nicht im aktuellen EORTC / MSG diagnostischen Kriterien enthalten.
Identifizierung von Aspergillus in histologischen Schnitten ist wegen der problematischen Simimäßigkeiten in Hyphen Morphologien mit anderen invasiven Pilzerreger 3 und bewährte Identifikation erfordert die Isolierung der Erreger in Reinkultur. Kultur-basierte Ansätze beruhen auf der Verfügbarkeit von Biopsie-Proben, aber diese sind nicht immer zugänglich in kranken Patienten, und nicht immer nachgeben lebensfähig Vermehrungseinheiten für Kultur, wenn erhalten.
Ein wichtiges Merkmal in der Pathogenese von Aspergillus ist Angio-Invasion, eine Eigenschaft, die Chancen, den Pilz zu verfolgen immunologisch mittels Tests, die charakteristische Signaturen antigenen Moleküle nachzuweisen im Serum und in der bronchoalveolären Lavage (BAL) Flüssigkeiten bietet. Dies hat zu der Entwicklung der Platelia Enzymimmunoassay (GM-EIA), die Aspergillus Galactomannan und eine "pan-Pilz"-Assay (Fungitell Test), die den konservierten Zellwand-Komponente erkennt (1 → 3)-β-D-detektiert geführt Glucan, aber nicht in den Mucorales, die diese Komponente in ihren Zellwänden 1,4 fehlt. Istverklagt rund um die Genauigkeit dieser Tests 1,4-6 hat auf die jüngste Entwicklung der nächsten Generation monoklonaler Antikörper (MAK)-basierte Assays, die Surrogatmarker der Infektion erkennen 1,5 geführt.
Thornton 5 Kürzlich beschrieb die Erzeugung eines Aspergillus-spezifischen mAb (JF5) unter Verwendung von Hybridom-Technologie und deren Verwendung, um eine Immun-chromatographisches Lateral-Flow-Gerät (LFD) für den Point-of-Care (POC) Diagnose von IPA zu entwickeln. Ein großer Vorteil des LFD ist seine Fähigkeit, die Aktivität zu erkennen, da MAb JF5 bindet an eine extrazelluläre Glykoprotein-Antigen, das während der aktiven Wachstum des Pilzes nur 5 sezerniert wird. Dies ist eine wichtige Überlegung bei der Verwendung von Flüssigkeiten, wie zB Lungen-BAL zur Diagnose IPA seit Aspergillus-Sporen ein gemeinsamer Bestandteil der Atemluft sind. Der Nutzen der Vorrichtung bei der Diagnose von IPA wurde gezeigt, mit einem Tiermodell der Infektion, wobei die LFD verbesserte Empfindlichkeit und Spezifikation angezeigtificity dem Platelia GM und Fungitell (1 → 3)-β-D-Glucan-Assays 7 verglichen.
Hier stellen wir ein einfaches Verfahren, um LFD Aspergillus-Antigen in humanem Serum und BAL-Flüssigkeiten zu erkennen. Seine Geschwindigkeit und Genauigkeit bietet eine neuartige Ergänzung Point-of-Care-Test zur Diagnose von IPA in malignen hämatologischen Patienten.
Definitive Identifizierung von IPA können nur dann wirklich durch Isolierung der Erreger aus Biopsie-Proben erreicht werden, sondern Wiederherstellung geeigneter Proben ist häufig nicht in sehr kranken Patienten möglich und Aspergillus ist selten wiederherstellbar aus dem Blut. Während die großen Fortschritte in der Anwendung von Computertomographie Abtasten der Brust in IPA Diagnose gemacht worden sind, sind Eigenschaften, die suggestive der pulmonalen IPA wie der "Halo" oder "Luft-Halbmond"-Schilder sind entweder flüchtig oder kann, um die Atmung Artefakten zugeschrieben werden oder andere Pilzinfektionen 11,12. Solche Daten sind deshalb mit serologischen Techniken, die zur Unterzeichnung Moleküle (GM und β-Glucan) aus Pilzen, die im Serum des Patienten im Umlauf sind oder, die in BAL-Flüssigkeiten, Sputum oder Urin-Proben ermittelt werden, 13 sind ergänzt. Während diese Tests zufriedenstellend Empfindlichkeit zeigen, fehlt ihnen ausreichende Spezifität oder leiden an Störungen unter bestimmten Bedingungen 1,6 </sup>.
Die LFD-Test für den IPA-Erkennung hier vorgestellten ermöglicht das "Point-of-Care" Diagnostik von IPA und Exploits Technologie, die verwendet wurde, um in Tests für den Nachweis von Viren, Bakterien, Parasiten und Giftstoffe 14-19 Laufenden und, am bekanntesten, für die Schwangerschaftstests zuerst von Unipath 1988 eingeführt. In der hier beschriebenen Aspergillus LFD wird die Aspergillus-spezifischen MAb JF5 einer Einfangzone (die Testlinie) auf einer porösen Nitrozellulosemembran immobilisiert. Anti-Maus-Immunglobulin immobilisiert auf die Membran in einer gesonderten Zone diente als eine interne Kontrolle (control line). Bei Zugabe von Serum oder BAL-Flüssigkeit zu der Öffnung für die Freisetzung bindet MAb JF5-Gold-Komplexe in der Freigabestellung Kontaktstelle mit der Ziel-Antigen und der Komplex dann entlang der porösen Membran durch Kapillarwirkung. MAb JF5 in der Abfangzone immobilisiert bindet an die JF5-Gold-Antigen-Komplexes, was zu einer roten Testlinie. Nicht gebundenes JF5-GoldKonjugat bindet an die interne Kontrolle darauf hinweist, dass der Test korrekt ausgeführt werden. Dies führt zu einer rote Kontrolllinie.
Der Test ist schnell, wobei nur 15 Minuten zu führen, ist billig im Vergleich zu Serum und BAL Tests an GM und β-Glucan-Erkennung basiert und erfordert keine teure Ausrüstung oder umfangreiche Laboreinrichtungen zu laufen. Darüber hinaus bedeutet MAb JF5 nicht mit den Drogen oder Verunreinigungen, die gezeigt haben, um falsch-positive Reaktion in der GM-und β-Glucan-Tests 1,4,6 verursachen kreuzreagieren. Ein weiterer großer Vorteil gegenüber aktuellen diagnostischen Tests ist die Fähigkeit, LFD Aktivität, die indikativ für invasive Wachstum von Aspergillus-Spezies ist zu erkennen.
Ein entscheidender Schritt bei der LFD Verfahren ist die Notwendigkeit zum Lesen der Ergebnisse von 15 min nach Anwendung des Serum oder BAL auf die Vorrichtung. Der Test sollte nicht länger als 15 min vor der Aufnahme die Ergebnisse gelassen werden, da dies zu Verzerrungen führen könnte interpretatiauf. Eine schwache Reaktion wird nicht durch die Verlängerung der Inkubationszeit verbessert werden. Wärmebehandlung von Serum aus Tiermodellen der Infektion wurde vor dem Test die Empfindlichkeit zu verbessern. Eine Einschränkung des Tests ist, dass es qualitative ist, und setzt auf die Betreiber, um eine subjektive Einschätzung der Positivität zu machen. Die Intensität der Testlinie variiert je nach den Antigen Inhalt Serum und BAL-Proben (1). Jedoch zeigt eine positive Reaktion (bestimmt durch Vergleich mit bekannten Negative) das Vorhandensein von Aspergillus Antigen und daher Infektion. Um die Subjektivität der LFD-Assays zu begrenzen, sind Handheld-Geräte verfügbar, die es erlauben die Quantifizierung der LFD Testlinie Intensitäten und ermöglichen die Festlegung von Schwellenwerten für Antigennachweis 20.
Zukünftige Entwicklungen des LFD sind seine Kommerzialisierung und die Entwicklung eines Multiplex-LFD, die simultane Detektion von anderen invasiven Pilzerreger erlaubtmit hochspezifischen MAbs 3.
The authors have nothing to disclose.
Finanzielle Unterstützung für Dr. Thornton von Pfizer Limited wird dankbar anerkannt.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Aspergillus LFD | University of Exeter | Available from the corresponding author on request | |
RPMI-1640 | Sigma | R0883 | |
L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
Fetal calf serum | Biosera | S9100 | Other sources of fetal calf serum can be used in the preparation of TCM |
EDTA | Fisher Scientific | BPE120-1 |