Выделение и культуре нейронов гиппокампа мышей от пренатального
Summary
Мы предоставляем протокол к культуре высокой степени очистки нейронов гиппокампа из мозга мышей пренатальной без использования подачи глиальных слоя клеток.
Abstract
Первичные культуры крысы и мыши нейронов гиппокампа широко использованы для выявления клеточных механизмов в области нейробиологии. Выделяя и рост отдельных нейронов, ученые могут анализировать свойства, связанные с оборотом сотовых, сотовые структуры и отдельные локализации белка с помощью различных биохимических методов. Результаты этих экспериментов очень важны для проверки теории решения нейронные основы памяти и обучения. Тем не менее, однозначного результата от этих форм эксперимента основана на способности к росту нейронов культур с минимальным загрязнением другие типы клеток мозга. В этом протоколе, мы используем конкретные средства массовой информации предназначена для роста нейронов и тщательного вскрытия эмбриональной ткани гиппокампа для оптимизации роста здоровых нейронов при минимизации загрязнения типах клеток (например, астроциты). Эмбриональные ткани гиппокампа мыши может быть более трудно выделить, чем аналогичные ткани грызунов, в связи с размером выборки для ди-ssection. Мы покажем, подробные методы вскрытия гиппокампе мышей из эмбриональных день 19 (E19) щенков. После ткани гиппокампа изолирован, нежный диссоциации нервных клеток достигается с помощью разбавленной концентрации трипсина и механическое разрушение, направленных на отдельные клетки соединительной ткани, обеспечивая при этом минимальный ущерб отдельные клетки. Подробное описание того, как подготовить пипетки, которые будут использоваться в нарушение включен. Оптимальная плотность покрытия предназначены для иммуно-флуоресценции протоколов максимально успешной культуре клеток. Протокол обеспечивает быструю (около 2 ч) и эффективный способ для культуры нервных клеток гиппокампа мышей из ткани.
Protocol
Discussion
Гиппокампа культур используются в молекулярной биологии уже более 20 лет. Хотя в принципе нейронных культур могут быть сделаны из любой части мозга, гиппокампа культуры оказались самыми популярными в связи с относительно простой архитектуры населения нервных клеток в гиппокампе 7.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Майкл Вутен за помощь в подготовке рукописи. Эта работа была поддержана NIH 2RO1NS033661 (MWW).
Materials
| Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
- Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
- Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
- Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
- Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
- Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
- Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
- Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
- Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).
