Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal
Summary
Nós fornecer um protocolo para a cultura de neurónios do hipocampo altamente purificado a partir de cérebros de rato pré-natal, sem a utilização de uma camada de células alimentador glial.
Abstract
As culturas primárias de rato e murina neurónios do hipocampo são amplamente utilizados para revelar os mecanismos celulares em neurobiologia. Com o isolamento e crescente neurónios individuais, os pesquisadores são capazes de analisar as propriedades relacionadas com o tráfico celular, a estrutura celular e localização de proteínas individuais usando uma variedade de técnicas bioquímicas. Os resultados de tais experiências são fundamentais para testar as teorias que abordam a base neural da memória e aprendizagem. No entanto, a partir de resultados inequívocos estas formas de experiências são baseadas na capacidade de crescer culturas neuronais com a contaminação mínima por outros tipos de células cerebrais. Neste protocolo, usamos meios específicos projetados para o crescimento dos neurônios e dissecção cuidadosa do tecido hipocampal embrionário para otimizar o crescimento de neurônios saudáveis, minimizando os tipos de células contaminantes (astrócitos, por exemplo). Tecido embrionário de rato do hipocampo pode ser mais difícil de isolar do que o tecido roedor semelhante, devido ao tamanho da amostra para o dissection. Mostramos técnicas de dissecação detalhadas de hipocampo de ratos filhotes embrionárias dia 19 (E19). Uma vez que o tecido do hipocampo é isolado, a dissociação suave de células neuronais é conseguido com uma concentração diluída de tripsina e ruptura mecânica concebido para separar células de tecido conjuntivo, proporcionando mínimo de danos para as células individuais. Uma descrição detalhada de como preparar pipetas para ser utilizado na ruptura é incluído. Densidades de revestimento ideais são fornecidas de imuno-fluorescência protocolos para maximizar a cultura de células de sucesso. O protocolo fornece uma técnica rápida (cerca de 2 horas) e eficiente para a cultura de células neuronais do hipocampo do rato a partir de tecido.
Protocol
Discussion
Culturas de hipocampo têm sido utilizados em biologia molecular para mais de 20 anos. Embora, em princípio, culturas neuronais pode ser feito de qualquer parte do cérebro, as culturas de hipocampo provaram ser os mais populares devido à arquitectura relativamente simples da população de células nervosas no hipocampo 7. Culturas do hipocampo são normalmente feitas de fase final de tecido embrionário. Este tecido é mais fácil para dissociar e contém menos células gliais do que o faz o tecido cerebr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Michael Wooten por sua ajuda na preparação do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH 2RO1NS033661 (MWW).
Materials
| Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
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