Summary

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Published: July 26, 2012
doi:

Summary

אנו מספקים פרוטוקול תרבות מטוהרים מאוד נוירונים בהיפוקמפוס של המוח עכבר טרום לידתי ללא שימוש שכבת תא גלייה מזין.

Abstract

תרבויות העיקריות של עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס Murine נמצאים בשימוש נרחב כדי לחשוף את המנגנונים התאיים בנוירוביולוגיה. על ידי בידוד הולך וגדל נוירונים בודדים, החוקרים מסוגלים לנתח מאפיינים הקשורים בסחר נייד, מבנה נייד ולוקליזציה חלבון הפרט באמצעות מגוון של שיטות ביוכימיות. תוצאות ניסויים אלה הם קריטיים לבדיקת תיאוריות העוסקות הבסיס העצבי של הזיכרון והלמידה. עם זאת, תוצאות ברורות של צורות אלה של ניסויים מבוססות על היכולת לגדול תרבויות עצביים עם זיהום מינימלי של סוגי תאים אחרים במוח. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בתקשורת ספציפיים המיועדים הצמיחה נוירון ו דיסקציה זהירה של הרקמה העוברית בהיפוקמפוס כדי לייעל צמיחה של נוירונים בריאים תוך מזעור סוגי תאים מזהמים (האסטרוציטים IE). עוברי רקמות העכבר ההיפוקמפוס יכול להיות קשה יותר לבודד מאשר רקמת מכרסם דומה בשל גודל המדגם עבור dissection. אנחנו מראים טכניקות הנתיחה מפורטים של ההיפוקמפוס מ גורים ביום 19 (E19) עובריים של עכברים. לאחר רקמת ההיפוקמפוס הוא מבודד, ניתוק עדין של תאים עצביים מושגת עם ריכוז מדוללת של טריפסין הפרעה מכנית נועד תאים נפרדים של רקמת חיבור, תוך מתן נזק מינימלי תאים בודדים. תיאור מפורט של איך להכין בטפי להחדרת נוזלים לשמש הפרעה כלול. צפיפות ציפוי אופטימליים ניתנים חיסונית הקרינה פרוטוקולים על מנת למקסם את תרבית תאים מוצלח. הפרוטוקול מספק שיטה מהירה (כ 2 שעות) ויעיל התרבות של תאים מרקמות העכבר בהיפוקמפוס.

Protocol

1. הגדרת לפני קציר כדי לייצר גורי טרום לידתי של הקציר נוירון, לתזמן הרבייה בין עכברים בוגרים 19 ימים לפני יום של בידוד תא העצב. (C57BL / 6 עכברים הגילאים 2-8 חודשים שימשו הזדווגויות למטרות פיתוח בפרוטוקול זה). זיווג מוצלח …

Discussion

תרבויות בהיפוקמפוס נעשה שימוש בביולוגיה מולקולרית של יותר מ -20 שנה. אמנם באופן עקרוני, תרבויות עצביים יכול להתבצע מכל חלק של המוח, בהיפוקמפוס תרבויות הוכיחו להיות פופולרי ביותר בשל הארכיטקטורה הפשוטה יחסית של האוכלוסייה תא העצב בהיפוקמפוס 7. תרבויות בהיפוקמפו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר מייקל ווטן על עזרתו בהכנת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 2RO1NS033661 (MWW).

Materials

Name of Reagent Vendor Catalog Number
Rat Tail Collagen 1 BD Biosciences 354236
Poly-D-lysine Solution Chemicon A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution Invitrogen 14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid Invitrogen 15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid Invitrogen 21103-049
B27 Supplement (50X) liquid Invitrogen 17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid Invitrogen 25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) Invitrogen 15140-148
HI-Donor Horse Serum Atlanta Biologicals S12150H

References

  1. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
  2. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
  3. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
  4. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
  5. Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
  6. Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
  7. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  8. Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
  9. Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
  10. Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
  11. Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
  12. Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
  13. Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
  14. Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).

Play Video

Cite This Article
Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. J. Vis. Exp. (65), e3634, doi:10.3791/3634 (2012).

View Video