العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة
Summary
ونحن نقدم بروتوكول للثقافة عالي النقاء الخلايا العصبية قرن آمون من أدمغة فئران قبل الولادة من دون استخدام خلية طبقة المغذية الغروية.
Abstract
وتستخدم على نطاق واسع الثقافات الأولية من الفئران والخلايا العصبية قرن آمون الفئران للكشف عن الآليات الخلوية في علم الأعصاب. من خلال عزل وتنامي الخلايا العصبية الفردية، والباحثين قادرون على تحليل الخصائص المتعلقة بالاتجار الخلوية، وبنية الخلية والفردية توطين بروتين باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات الحيوية. نتائج من مثل هذه التجارب لاختبار حاسم نظريات معالجة أساس العصبية للذاكرة والتعلم. ومع ذلك، وتستند النتائج لا لبس فيه من هذه الأشكال من التجارب على قدرته على النمو مع الثقافات العصبية تلوث الحد الأدنى من غيرها من أنواع خلايا الدماغ. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم وسائل الاعلام الخاصة المصممة لنمو الخلايا العصبية وتشريح دقيق من الأنسجة الجنينية الحصين لتحسين نمو الخلايا العصبية السليمة مع التقليل من أنواع الخلايا الملوثة (أي الخلايا النجمية). يمكن الجنينية الماوس الأنسجة الحصين يكون من الصعب عزل من الأنسجة القوارض مماثلة نظرا لحجم العينة لديssection. نعرض تقنيات تشريح مفصل من الحصين من الجنينية الجراء الفار يوم 19 (E19). بمجرد أن يتم عزل الأنسجة قرن آمون، ويتحقق انفصال لطيف من الخلايا العصبية مع تركيز مخفف من التربسين وتعطيل آلية تهدف إلى خلايا منفصلة من النسيج الضام مع توفير الحد الأدنى من الضرر لخلايا فردية. ويرد وصف مفصل لكيفية تحضير الماصات لاستخدامها في تعطيل. وتقدم كثافة الطلاء الأمثل لالمناعة مضان بروتوكولات لتعظيم نجاح زراعة الخلايا. ويقدم هذا البروتوكول تقنية سريع (حوالي 2 ساعة) وفعالة للثقافة من الخلايا العصبية من الأنسجة الماوس قرن آمون.
Protocol
Discussion
وقد استخدمت الثقافات قرن آمون في البيولوجيا الجزيئية لأكثر من 20 عاما. في حين من حيث المبدأ، ويمكن إجراء الثقافات الخلايا العصبية من أي جزء من الدماغ، وقد أثبتت الثقافات الحصين ليكون الأكثر شعبية نظرا لبنية بسيطة نسبيا من سكان الخلية العصبية في قرن آمون 7. تكون ع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور مايكل وتن لمساعدته في إعداد المخطوط. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة 2RO1NS033661 (MWW).
Materials
| Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
- Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
- Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
- Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
- Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
- Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
- Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
- Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
- Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).
