Summary

L'isolement et la culture de neurones de l'hippocampe de souris pendant la grossesse

Published: July 26, 2012
doi:

Summary

Nous fournissons un protocole pour la culture de neurones de l'hippocampe hautement purifiée à partir de cerveaux de souris prénatales sans l'utilisation d'une couche de cellules nourricières gliales.

Abstract

Les cultures primaires de rat et de souris neurones de l'hippocampe sont largement utilisés pour révéler les mécanismes cellulaires de la neurobiologie. En isolant et en pleine croissance des neurones individuels, les chercheurs sont capables d'analyser les propriétés liées à la traite cellulaire, structure cellulaire et la localisation des protéines individuelles en utilisant une variété de techniques biochimiques. Les résultats de ces expériences sont essentiels pour tester les théories portant sur les bases neurales de la mémoire et l'apprentissage. Cependant, des résultats sans ambiguïté de ces formes d'expériences sont fondées sur la capacité de croître des cultures de neurones à la contamination minimale par d'autres types de cellules du cerveau. Dans ce protocole, nous utilisons des supports spécifiques conçus pour la croissance des neurones et une dissection minutieuse du tissu hippocampique embryonnaire pour optimiser la croissance des neurones sains tout en minimisant les types de cellules contaminantes (astrocytes par exemple). Embryonnaire de la souris tissu hippocampique peut être plus difficile d'isoler que les tissus des rongeurs similaire en raison de la taille de l'échantillon pour dissection. Nous montrons les techniques de dissection détaillée de l'hippocampe à partir embryonnaires souriceaux jour 19 (E19). Une fois le tissu hippocampique est isolée, la dissociation des cellules neuronales douce est obtenue avec une concentration diluée de la trypsine et la rupture mécanique des cellules destiné à séparer les tissus conjonctifs tout en fournissant un minimum de dégâts à des cellules individuelles. Une description détaillée de la façon de préparer les pipettes à être utilisé dans la perturbation est inclus. Densités optimales de placage sont prévus pour l'immuno-fluorescence protocoles afin de maximiser la culture de cellules avec succès. Le protocole prévoit une technique rapide (environ 2 h) et efficace pour la culture des cellules neuronales à partir de tissus de la souris hippocampe.

Protocol

1. Mise en place avant la récolte Pour générer chiots prénatales pour la récolte des neurones, planifier la reproduction entre les souris adultes 19 jours avant le jour de l'isolement des neurones. (C57BL / 6 ans 2-8 mois ont été utilisés dans les accouplements pour les fins de l'élaboration de ce protocole). Accouplement réussi peut être confirmé par la détection d'un bouchon vaginal dans la confirmation de femmes, des palpitations ou visuelle de la grossesse. Le j…

Discussion

Cultures hippocampe ont été utilisés en biologie moléculaire pour plus de 20 ans. Bien qu'en principe, les cultures de neurones peuvent être fabriqués à partir de n'importe quelle partie du cerveau, l'hippocampe cultures se sont révélées être les plus populaires en raison de l'architecture relativement simple de la population de cellules nerveuses dans l'hippocampe 7. Cultures d'hippocampe sont généralement fabriqués à partir de tard-étape tissu embryonnaire. Ce tissu e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Michael Wooten pour son aide dans la préparation du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH 2RO1NS033661 (MWW).

Materials

Name of Reagent Vendor Catalog Number
Rat Tail Collagen 1 BD Biosciences 354236
Poly-D-lysine Solution Chemicon A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution Invitrogen 14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid Invitrogen 15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid Invitrogen 21103-049
B27 Supplement (50X) liquid Invitrogen 17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid Invitrogen 25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) Invitrogen 15140-148
HI-Donor Horse Serum Atlanta Biologicals S12150H

References

  1. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
  2. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
  3. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
  4. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
  5. Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
  6. Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
  7. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  8. Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
  9. Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
  10. Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
  11. Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
  12. Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
  13. Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
  14. Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).

Play Video

Cite This Article
Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. J. Vis. Exp. (65), e3634, doi:10.3791/3634 (2012).

View Video