Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen
Summary
Wij bieden een protocol voor de cultuur van sterk gezuiverd hippocampale neuronen van prenatale muis hersenen zonder het gebruik van een feeder-gliale cellaag.
Abstract
Primaire culturen van ratten en muizen hippocampale neuronen worden op grote schaal gebruikt om cellulaire mechanismen te onthullen in de neurobiologie. Door te isoleren en groeiende individuele neuronen, onderzoekers zijn in staat om eigenschappen met betrekking tot mobiele handel, cellulaire structuur en individuele eiwit lokalisatie behulp van een verscheidenheid van biochemische technieken te analyseren. De resultaten van dergelijke experimenten zijn van cruciaal belang voor het testen van theorieën het aanpakken van de neurale basis van het geheugen en leren. Echter ondubbelzinnig resultaten van deze experimenten vormen gebaseerd op het vermogen om neuronale kweken groeien minimum verontreinigende andere hersenen celtypen. In dit protocol gebruiken we specifieke media ontwikkeld voor neuron groei en zorgvuldige dissectie van de embryonale hippocampus weefsel om de groei van gezonde neuronen te optimaliseren terwijl het minimaliseren van vervuilende soorten cellen (dwz astrocyten). Embryonale muis hippocampale weefsel moeilijker te isoleren dan vergelijkbare knaagdier weefsel door de grootte van het monster voor dissection. We tonen gedetailleerde dissectie technieken van de hippocampus van embryonale dag 19 (E19) muis pups. Zodra de hippocampus weefsel wordt geïsoleerd, is zacht dissociatie van neuronale cellen bereikt met een verdunde concentratie van trypsine en mechanische verstoring ontworpen om afzonderlijke cellen van het bindweefsel, terwijl het verstrekken van minimale schade aan de individuele cellen. Een gedetailleerde beschrijving van het pipetten bereiden voor gebruik in de onderbreking is opgenomen. Optimale plating dichtheden zijn bedoeld voor immuno-fluorescentie protocollen voor een succesvolle celkweek te maximaliseren. Het protocol biedt een snelle (ongeveer 2 uur) en efficiënte techniek voor de cultuur van de neuronale cellen van de muis de hippocampus weefsel.
Protocol
Discussion
Hippocampale culturen werden in de moleculaire biologie voor meer dan 20 jaar. Hoewel in principe neuronale kweken kan worden gemaakt van een deel van de hersenen, hebben hippocampale culturen gebleken de meest door de relatief eenvoudige structuur van de zenuw cellen in de hippocampus 7. Hippocampale culturen zijn meestal gemaakt van een laat stadium embryonaal weefsel. Dit weefsel is gemakkelijker om zich te distantiëren en bevat minder gliacellen dan wel volwassen hersenweefsel 1. Isolatie van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Michael Wooten voor zijn hulp bij de voorbereiding van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH 2RO1NS033661 (MWW).
Materials
| Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
- Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
- Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
- Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
- Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
- Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
- Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
- Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
- Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).
