Cuantitativos y automatizada de alto rendimiento del genoma completo de RNAi pantallas en C. elegans</em

El protocolo se describe a continuación se divide en cinco pasos en días sucesivos (Fig. 1). Como se ha señalado, ciertos pasos se puede hacer en diferentes días. La duración de cada etapa, así como la cantidad de material requerido (por ejemplo, gusanos, bacterias, los medios de comunicación) dependerá del número de placas de 96 pocillos tratados por experimento. Día 1 1. Preparación de las placas 96-así NGM RNAi El siguiente protocolo es una adaptación del método estándar para hacer las placas de cultivo del gusano 10, que incluye detalles de las técnicas de esterilización para las distintas soluciones. Por 10-12 placas de 96 pocillos, preparar 100 ml de medio de crecimiento de nematodos (NGM) en agua desionizada 2 O: 1,7 g bactoagar, 0,29 g de NaCl, 0,25 g de peptona, 100 colesterol l (5 mg / ml en EtOH). Autoclave NGM (5 minutos a 121 ° C durante 100 ml, 30 minutos a 121 ° C durante 4 litros) y dejar enfriar hasta que esté a unos 50 ° C (apenas fresco enough para celebrar). Es importante que el NGM se mantiene caliente lo suficiente como para que no solidifique. Añadir a 100 ml: 2,5 ml de tampón de fosfato pH 6 (1M), 100 l MgSO 4 (1M), 100 l de CaCl 2 (1M), 400 l de IPTG (1M), 100 l de ampicilina (100 mg / ml), 100 l de tetraciclina (12,5 mg / ml en EtOH). Distribuir 75 l de NGM a cada pocillo de un 96-así placa de fondo plano. Para evitar la solidificación del medio, tiene que ser dispensado rápidamente, es conveniente usar un dispensador repetitivo (por ejemplo Repeatman, Eppendorf). Asegúrese de que no hay burbujas de aire presentes en los pozos. Guarde las placas de inmediato en una cámara húmeda (por ejemplo, una caja de Tupperware con toallas de papel húmedas en la parte inferior) a 4 ° C. Nota: Las placas se pueden preparar hasta una semana antes y se almacena a 4 ° C, lo que puede hacer que la organización de las etapas subsiguientes más fácil. 2. Preparación automatizada de las placas de LB 96-DeepWell <li> Preparación y distribución de 1,5 ml de LB que contiene ampicilina y tetraciclina 100μg/mL 12,5 mg / ml a cada pocillo de una placa de 96 Deepwell que tiene una capacidad máxima de 2 ml / pocillo. La distribución está optimizada utilizando un sistema robótico de manejo de líquidos (por ejemplo TECAN) pero también se puede realizar manualmente, si es necesario. Añadir una cubierta para cada plato y se almacena a 4 º C. Con el fin de realizar un seguimiento de cada placa de 96 pocillos, una etiqueta de código de barras único, o hay que añadir, en este momento o posteriormente. Nota: Las placas se pueden preparar de 2 a 3 días de antelación y se almacena a 4 ° C, lo que puede hacer que la organización de las etapas subsiguientes más fácil. 3. Crecer los clones bacterianos RNAi en las placas LB-96 (DeepWell cultivo de una noche) Para facilitar su posterior manipulación, cuando los originales RNAi clones de la biblioteca están en un formato de 384 pocillos, redistribuir primero de los clones en el etiquetado o un código de barras estándar de 96 y placas que contengan LB con 100 mg / ml Amp y 12,5 mg / ml Tet suplementado con glicerol (10% de concentración final). Cuando las placas originales de 384 y no tiene clones en todos los pozos, como es el caso de los más comúnmente utilizados "Ahringer" biblioteca, hay varias opciones para organizar las placas hija. Los clones que puede ser re-distribuidos de manera que no existen pozos vacíos en las placas hija. Esto minimiza el número de placas de pantalla. Lo ideal sería que, sin embargo, durante la replicación, algunos pozos en cada plato hija debe dejarse en blanco, para que éstos posteriormente se puede llenar con los clones de control estándar (positivo y negativo) que facilitan a través de comparaciones de placa. Estas placas hija 96-y se utilizan entonces para las semillas de las placas de LB 96-DeepWell para una noche (ON) la cultura. Todas las etapas de manipulación de líquidos se realiza mejor con un sistema de manipulación robótica líquido (por ejemplo, Tecan), pero se puede realizar manualmente utilizando, por ejemplo, un replicador de 96-patillas. Si los clones de RNAi de la biblioteca ya están en un formato de 96 y vaya al paso 3.5. <ol inicio = "2"> Incubar las placas 96-así RNAi hija a 37 ° C con agitación (200 rpm) durante 14-15 horas. Compruebe que las bacterias crecieron correctamente e identificar los clones que no crecieron. Estos serán excluidos de los análisis posteriores. Idealmente, el diámetro exterior 600 se mide en cada pocillo, pero esto puede hacerse por simple inspección. Almacenar las placas 96-así RNAi hija a -80 ° C antes de su uso. Descongelar las placas de 96 pocillos que contienen los clones ARNi a temperatura ambiente. Las placas se pueden mantenerse a 4 ° C hasta su uso. Distribución de 3 l de cada clon bacteriano a partir de una placa de 96 pocillos se replican en los 96 pocillos de la placa LB debidamente etiquetado / código de barras de 96 Deepwell que contiene 1,5 ml de LB con 100 mg / ml Amp y 12,5 mg / mL del Tet. Clones bacterianos para controlar la eficiencia ARNi, tales como un GFP (ARNi) clon en el presente ejemplo, y los controles negativos, se pueden incorporar de forma manual en cualquier pozo vacío disponible. Cubra la p 96-Deepwellse correlaciona con una película adhesiva (por ejemplo, la película AeraSeal cultivo celular a partir Dutscher). Vuelva a colocar la placa, que de 96 pozos réplica a -80 ° C. Las placas 96-DeepWell etiquetados se incuban a continuación ON a 37 ° C con agitación (200 rpm durante 14-15 horas). Día 2 4. Semillas los clones bacterianos RNAi sobre las placas de 96 pocillos NGM RNAi Este paso debe hacerse en la mañana siguiente a la cultura en ON. Tome las placas de 96 pocillos NGM de 4 ° C y dejar que se caliente y se seque durante 5-15 minutos bajo una campana de flujo laminar estéril. No deje los platos demasiado tiempo bajo el capó (máximo 30 minutos), ya que de lo contrario el NGM posteriormente se puede romper. Añadir la etiqueta apropiada / código de barras a cada plato. Recuperar el 96-Deepwell en placas de cultivo de 37 ° C. Anote las posiciones de los pozos de vacío (un vacío y es totalmente transparente), los cuales serán excluidos de los análisis posteriores. Centrifugar el 96-Deepwell placas de 5 min a 4000 rpm. Consejo el sobrenadante, girando la placa bruscamente hacia abajo y secar los bordes de la placa rápidamente sobre una toalla de papel. A medida que los cultivos son de bacterias recombinantes, el sobrenadante necesita ser tratada de acuerdo con las regulaciones locales (por ejemplo, tratada en autoclave). Resuspender el sedimento bacteriano en el líquido residual (aproximadamente 50 l) por agitación, idealmente utilizando un agitador dedicado (por ejemplo, Tecan) de manera que cada placa recibe precisamente el mismo tratamiento. Es posible medir el diámetro exterior 600 de cada pocillo para normalizar precisamente el inóculo bacteriano para la etapa subsiguiente, pero esto no es indispensable, y no realizar dicha comprobación. Transferir 5 ml de las bacterias resuspendidas en las placas de 96 pocillos NGM con un 8 o 12 canales multi-pipeta. Tenga cuidado de no tocar o penetrar en la NGM. Este paso se realiza manualmente, pero se puede optimizar utilizando un robot como el Liquidator96 (Rainin) que permite eldistribución de 96 clones de RNAi en un paso. Que las bacterias en seco bajo una campana de flujo laminar estéril, comprobando regularmente para evitar el NGM se seque demasiado. Este paso debería tomar alrededor de 2 horas. Incubar los 96-y RNAi NGM placas a 37 ° C en una cámara húmeda. 5. Preparar una población sincronizada de los gusanos Para este paso, usamos los gusanos transgénicos portadores del gen reportero (s) de interés (por ejemplo, una infección de p-inducible PNL-29 :: GFP construir y, como un control interno, la construcción de un constituyente p col-12 :: dsRed transgén) . A causa de la disminución observada de la expresión transgénica con el tiempo, descongelar lotes frescos de gusanos cada 6 semanas. Nosotros, los gusanos de la cultura por lo menos 2 generaciones antes de su uso, y asegurar que los gusanos no han muerto de hambre antes del ensayo. Si el día 2 del protocolo es el martes, preparamos los gusanos del viernes mediante la colocación de 30 gusanos adultos jóvenes en una placa de 9 cm NGM se extendió con OP50 bacteriasa 20 ° C, que estará listo para blanquear el martes (ver Tabla 1). Gusanos Bleach tras el protocolo estándar 10. Deje que los huevos eclosionan en M9 a 25 ° C ON con agitación para obtener una población de sincronizada de larvas L1. Día 3 6. Distribución de los gusanos en los 96-y RNAi NGM placas para la alimentación y el ARNi Este paso debe hacerse en la mañana. Gusanos L1-fase sincronizada se distribuyen en cada clon 96-bacteriana y para la alimentación y RNAi. Recuperar los 96-y RNAi NGM placas de 37 ° C y dejarlos a temperatura ambiente se enfríe. Recuperar los gusanos blanqueada de 25 ° C. Estimar el número de gusanos por 2 l y ajustar con M9 tener alrededor de 100 a 120 gusanos por 2 l (aproximadamente una gota). Distribuir manualmente 2 l de gusanos fase L1 en cada pocillo utilizando un dispensador repetitivo. Revise cada bien para los gusanos (debería ver los gusanos que nadan en líquido). Que las placas seco bajo una campana de flujo laminar estéril (máximo 1 hora). Revise periódicamente las placas, los gusanos se debe gatear y la natación no. Tenga cuidado, el NGM no se seque demasiado, de lo contrario se romperá. Colocar las placas a 25 ° C en una cámara húmeda. 7. Pon a prueba las esporas Drechmeria coniospora efectiva para la infección Este paso es específico para la pantalla actual. Consiste en la prueba de los diferentes lotes de esporas para seleccionar los altamente infecciosos. Por lo tanto, debe hacerse tan cerca como sea posible antes del día 4, el día de la infección. Es necesario preparar suficientes L3-L4 gusanos de antemano para estas pruebas (Tabla 1). Detalle de los métodos necesarios para la D. coniospora la cultura se han descrito en otro lugar 11. <ol> Recoger las esporas a partir de una muestra de cada cultivo fúngico en un pequeño volumen de M9. Ponga una gota de cada suspensión de esporas en una placa de 35 mm NGM sembrado con OP50, y deje que se seque. Añadir 30-40 L3-L4 gusanos que llevan el gen reportero de interés (por ejemplo, p PNL-29 :: GFP). Coloque las placas infectadas a 25 ° C en ON. Al día siguiente, visita a los gusanos para la inducción de las buenas prácticas agrarias y seleccionar el lote de hongo que le da la más brillante, la inducción amplia y homogénea de la mayoría de fluorescencia de color verde. Día 4 8. Infect los gusanos RNAi expuesta con D. coniospora esporas Este paso se realiza 30 horas después de RNAi de alimentación cuando los gusanos se han llegado a la fase L3-L4. Determinar el volumen de las esporas a utilizar para distribuir 4 l por pocillo. Recoger fresca D. coniospora esporas del lote seleccionado con tampón M9. Utilizar 8-10 ml de M9 para una placa de 9 cm de esporas. <li> Distribuir 4 l de esporas en cada pocillo con un dispensador repetitivo. Revise cada pocillo para que las esporas (se puede ver la piscina gusanos en líquido). Que las placas en seco bajo una campana de flujo laminar estéril (aproximadamente 1 hora). Revise las placas de forma regular hasta que los gusanos iniciar el rastreo. Tenga cuidado, el NGM no se seque demasiado, de lo contrario se romperá. Colocar las placas infectadas a 25 ° C en una cámara húmeda. Día 5 9. La observación y el almacenamiento de las placas antes del análisis cuantitativo automatizado Este paso se inicia 18 horas después de la infección y se lleva a cabo durante 5 días. Los gusanos se espera que sean los adultos jóvenes que empiezan a poner huevos. Durante este paso, el fenotipo se anotó visualmente: o gusanos fluorescencia verde que corresponde a una situación normal después de la infección, o la inducción de la GFP se altera en un pozo dado que significa que los cambios en los genes silenciados la respuesta a la infección. <li> rápidamente observar las placas bajo el microscopio de fluorescencia de disección. Si las placas muestran una buena inducción buenas prácticas agrarias en general a continuación, proceder al siguiente paso, de lo contrario esperar hasta la tarde para una mejor inducción, siempre y cuando no hay todavía queda comida para los gusanos. Visualmente marcar cada plato y tomar nota de cualquier pozo con un fenotipo marcado (por ejemplo, no la expresión de GFP). Por la comprobación de los resultados obtenidos con los clones de control de ARNi que se haya añadido, este análisis preliminar da una indicación de si el experimento ha tenido éxito. El uso de un 8 o 12 canales múltiples con una pipeta de transferencia de los gusanos con 100 l de NaCl 50 mM, Tritón 0,05%, a una nueva forma correspondiente con la etiqueta / código de barras de 96 pocillos de fondo redondo de la placa. Congelar las placas a -80 ° C hasta su análisis. En el día del análisis, descongelar las placas a temperatura ambiente y proceder al análisis automatizado utilizando el Biosort COPAS. El clasificador se analiza una sola placa en 22 minutos. Las placas no debe serdejó a temperatura ambiente durante más de una hora antes del análisis, y no pueden ser congelados de nuevo. La información obtenida de la Biosort COPAS se transcriben en un archivo de Excel para la verificación superficial de la calidad de los datos. Los datos en bruto con los distintos parámetros medidos por el Biosort COPAS (densidad óptica (extinción), la longitud axial (tiempo de vuelo), las emisiones de fluorescencia, de forma simultánea por tres detectores diferentes) se almacenan en un paquete dedicado LIMS (LIMS mBio, Modul- Bio) para su posterior análisis cuantitativos detallados. 10. Los resultados representativos Usando las cantidades de gusanos y bacterias dadas anteriormente, al final del experimento, en la mayoría de los pozos, todos los animales deben haber desarrollado hasta la edad adulta y todavía debe ser algo de comida que queda en todos los pocillos. Bajo estas condiciones, la mayoría de los pozos también debe contener huevos. No debe haber un número suficiente de adultos en cada pocillo de modo que Biosort datos se obtiene fo por lo menos 50 gusanos individuales. Por otro lado, si el ARNi es eficiente, un gran número de clones RNAi provocará un fenotipo visible. Por ejemplo, los gusanos pueden ser falta de coordinación, o, evidentemente, más, estéril, o detenido en su desarrollo. Esto debe ocurrir con frecuencia, así que por lo general al menos un pozo por cada placa de 96 pocillos contiene los gusanos con un evidente fenotipo RNAi. Cuando el fenotipo de interés es la expresión de un gen reportero GFP, los pozos con las buenas prácticas agrarias (RNAi), clon de proporcionar un control robusto (Fig. 2). Otros fenotipos, tales como una alteración de tamaño puede medirse fácilmente con la Biosort (fig. 3A). Se observó que los gusanos podrían migrar a los pozos adyacentes a una frecuencia muy baja (<1%, BS, resultados no publicados) cuando el alimento en un lugar bien ha agotado. El derribo de la función de las diferentes clases de genes puede afectar la expresión de transgenes en C. elegans. Algunos no son ni las exigencias específicas de la expresión de los transgenes 12. Otros, talescomo factores de transcripción específicos de tejido, por ejemplo el factor epidérmico GATA ELT-3 13, se requerirá en subconjuntos particulares de células. Esta es una de las razones para la inclusión de una epidérmica de células no relacionado y constitutiva constructo reportero transgén (p col-12 :: dsRed) en la cepa utilizada para el protocolo actual. Esto permite que dichos genes deben distinguirse de las específicamente involucrados en el proceso de regulación de genes bajo estudio (Fig. 3B y C). Este transgén se expresa en todas las etapas larvales. Si un ensayo implica la detección de la expresión génica en embriones un gen reportero de control diferente sería necesario. Una de las novedades de este protocolo es el uso de placas de congelación a posponer su análisis. La congelación permite que las placas se almacenan para un máximo de dos semanas sin alterar sustancialmente los resultados. Aunque los valores absolutos de fluorescencia medida puede ser cambiado, sus proporciones relativas siendo similar (Fig. 4). En el Antiguo Testamentola mano, el ARNi es un procedimiento experimental 14 intrínsecamente variable. Para obtener resultados sólidos y eliminar los posibles falsos positivos, las pantallas de RNAi necesita que se realicen, al menos una vez. Si los experimentos se realizó con éxito, debe haber una correlación razonable entre los resultados de una placa de prueba en días diferentes. En particular, los genes que tienen un fuerte efecto debe ser claramente identificable, aun cuando su efecto cuantitativa precisa no es idéntica entre las placas duplicadas (Fig. 5). Figura 1. Esquema general para un experimento típico. Figura 2. Control de RNAi utilizando un clon objetivo la expresión de GFP. Transgénicos gusanos expressing constitutivamente col AP-12 :: reportero dsRed y una inducible p PNL 29 :: GFP reportero en medio sólido en una placa de 96 pocillos visualizan mediante un microscopio de disección de las buenas prácticas agrarias con un conjunto de filtros que permite la observación simultánea de fluorescencia de color rojo y verde. Los gusanos fueron expuestos a controlar (paneles superiores) o un clon de las buenas prácticas agrarias RNAi (paneles inferiores) durante 48 h. Los paneles de la izquierda son los gusanos infectados, las de los gusanos de derecho de 18 horas después de la infección con D. coniospora. La barra de escala es de 1 mm. Figura 3. El análisis cuantitativo de una placa de 96 pocillos. El Biosort COPAS genera datos numéricos de cada gusano analizadas. Los gráficos muestran el promedio y la desviación típica del tiempo de vuelo (TOF; A) que corresponde al tamaño de los gusanos 15, fluorescencia roja (B) y la relación (X100) de fluorescencia verde a TOF (C) de transgénico WOrms expresando constitutivamente AP col-12 :: reportero dsRed y una inducible p PNL 29 :: GFP reportero que había sido cultivado en un medio sólido en placas de 96 pocillos con diferentes clones de RNAi durante 48 horas, 18 horas después de la infección con D. coniospora. Ciertos clones, tales como la una destacada con la flecha en (A), provocan defectos crecimiento y / o afectar a la expresión de p col-12 :: dsRed. Otros, afectan específicamente a la expresión de GFP, como se destaca por la flecha en (C). Este clon particular, se dirige a la nsy gen 1, previamente demostrado ser importante para la regulación de la PNL 29 13. Verde, rojo de fluorescencia y árboles fuera del bosque se miden en unidades arbitrarias, pero constante. Figura 4. CompArison de los datos obtenidos con las muestras en vivo y congelado desde el mismo experimento. Las placas de L4 gusanos que llevan p PNL-29 :: GFP y col p-12 :: DsRed transgenes estaban infectados ya sea con D. coniospora o no. Después de 18 horas, cada placa se divide aproximadamente en 2; medio se analizó inmediatamente y medio congelado a -80 ° C durante 24 horas, antes de la descongelación y análisis. Los valores de promedio de TOF (tamaño de los gusanos), EXT (densidad óptica) y Green y fluorescencia de color rojo se calcularon para cada muestra. El gráfico muestra la relación de la media de infectados dividido por no infectadas muestras, para las muestras congeladas y en vivo (n = 7638 y 5096, y 8634 y 3850 gusanos, respectivamente). Figura 5. Análisis comparativo de los duplicados de placas de 96 pocillos. La relación de fluorescencia normalizada (la relación media de fluorescencia (aquí, 100 * verde / TOF) para cada pozo dividido porel recortado (25 º al 75 º percentil) significa que por cada placa) para cada pozo de los análisis por duplicado de un representante de placas de 96 pocillos. Material Línea de tiempo experimental IPTG: ~ 1,4 ml Ampicilina: ~ 5 ml Tetraciclina: ~ 5 ml LB: 5 l Placas de 96 pocillos planos: 30 para NGM Placas de 96 pocillos redondos: 30 para la congelación (Análisis) 96-DeepWell placas: 30 para la cultura ON película de la cultura: 30 Consejos cuadro: 30 para la siembra de bacterias 9 cm OP50 placas: ~ 17 Worms: un recién descongelada cyrovial por mes Esporas: ~ 2 placas NaCl 50 mM + Triton 0,05%: ~ 300 ml Jueves Preparar el ARNi NGM placas de 96 pocillos (~ 1 h + autoclave) Viernes Preparar las placas LB (96-DeepWell ~ 4h) Preparar los gusanos (14 placas con 30 gusanos adultos jóvenes a 20 ° C + 1 placa a 25 ° C) Lunes Transferencia de los gusanos de la placa a 25 ° C en la placa nueva Distribuir bacterias en placas de LB (~ 7h) Sobre la cultura a las 6 pm Martes Distribución de las bacterias en las placas de NGM en la mañana (~ 3 horas+ Del ~ 2h secado) Bleach gusanos de las placas a 20 ° C Miércoles Distribución de los gusanos a las 10 horas (1h + ~ del ~ 1h secado) Esporas de prueba con los gusanos de la placa a 25 ° C Jueves Infect gusanos a las 3 pm (1h + ~ del ~ 1h secado) Viernes Traslado en placas de 96 pocillos + congelación (~ 2 h) nueva Tabla 1. Ejemplo de un experimento de un ciclo con 30 platos. Aquí se presenta el material necesario para un experimento de un ciclo de 30 placas y un cronograma para un experimento del paso 1 al paso 12 organizado en 9 días. Medios de crecimiento de nematodos (NGM), 100 ml: 0.3 g NaCl 0,25 g Bactopeptona 2 g Bactoagar 100 l 5 mg / ml de colesterol en EtOH Añadir agua desionizada a 100 mL Autoclave durante 5 minutos a 121 ° C y dejar enfriar, a continuación, añadir: 100 l 1 M MgSO 4 100 l 1 M CaCl 2 2,5 ml 1 M pH 6,0 KPO 4 NGM para el tratamiento de RNAi en placas de 96 pocillos, 100 ml: 0,29 g NaCl 0,25 g Bactopeptona 1,7 g Bactoagar 100 l 5 mg / ml de colesterol en EtOH Añadir de agua desionizada a 100 mL Autoclave durante 5 minutos a 121 ° C y dejar enfriar, a continuación, añadir: 100 l 1 M MgSO 4 100 l 1 M CaCl 2 2,5 ml 1 M pH 6,0 KPO 4 400 l 1 M IPTG 100 l 100 mg / ml de ampicilina 100 l 12,5 mg / ml de tetraciclina Solución de cloro, 5 ml: 2,5 ml de H 2 O 2,3 ml Bleach 0,2 ml de NaOH 50% NaOH al 50%, 100 ml: 50 g de NaOH Añadir agua desionizada a 100 mL NaCl 50 mM, Tritón 0,05%, 400 ml: 4 ml de NaCl 5 M 1 ml de Triton 20% Añadir agua desionizada a 400 ml tep "> Triton 20%, 10 ml: 2 ml de Triton X-100 8 ml de agua desionizada M9 tampón, 1L 6 g de Na 2 HPO 4 (PM: 178) 3 g de KH 2 PO 4 (PM: 136) 5 g de NaCl Añadir agua desionizada a 1 L Autoclave Añadir 1 ml MgSO 4 1 M Caldo Luria (LB), 1 litro: 10 g de bactotriptona 20 g de extracto de levadura 10 g de NaCl Añadir agua desionizada a 1 L Autoclave 1 M MgSO $ 4, 300 ml: 73,95 g de MgSO 4 Añadir agua desionizada a 300 mL Autoclave y almacenar a temperatura ambiente 5 mg / colesterol ml, 200 ml: 1 g de colesterol Añadir 100 EtOH% a 200 ml Filtrar esterilizar y almacenar a temperatura ambiente 1 M CaCl 2, 500 ml: 27.75 g de CaCl 2 Añadir agua desionizada a 500 ml Filtrar esterilizar y almacenar a temperatura ambiente 1 M KPO 4 pH 6,0, 4 L: 517 g de KH 2 PO 4 (PM: 136) 207 g de K 2 HPO 4 (PM: 174) Añadir agua desionizada a 4 L 100 mg / ml de ampicilina (Amp), 10 ml: 1 g de ampicilina Añadir agua desionizada a 10 mL Almacenar a -20 ° C 1 M isopropílico β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), 10 ml: 2,38 g de IPTG Añadir agua desionizada a 10 mL Almacenar a -20 ° C 12,5 mg / ml de tetraciclina, 100 ml 1,25 g de tetraciclina Añadir 100 EtOH% a 100 ml Tabla 2. Soluciones.