Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans</em

Il protocollo, come descritto di seguito è suddivisa in passi su cinque giorni consecutivi (Fig. 1). Come notato, alcuni passi può essere effettuata in giorni diversi. La durata di ogni fase, così come la quantità di materiale richiesto (vermi ad esempio, batteri, media) dipenderà dal numero di piastre da 96 pozzetti trattati per esperimento. Giorno 1 1. Preparazione dei 96 e NGM piastre RNAi Il protocollo seguito è adattato dal metodo standard per la creazione piastre di coltura a vite senza fine 10, che comprende i dettagli delle tecniche di sterilizzazione per le diverse soluzioni. Per 10-12 piastre a 96 pozzetti, preparare 100 mL di mezzi di crescita nematodi (NGM) in H 2 O deionizzata: 1,7 g BactoAgar, 0,29 g di NaCl, 0,25 g peptone, colesterolo 100 pl (5 mg / mL in EtOH). Autoclave NGM (5 min a 121 ° C per 100 mL; 30 min a 121 ° C per 4 L) e lasciate raffreddare fino a quando non si trova a circa 50 ° C (solo freddo Enough tenere). È importante che la NGM rimane abbastanza caldo in modo che non si solidifichi. Aggiungere per 100 mL: 2,5 mL tampone fosfato pH 6 (1M), 100 pl MgSO 4 (1M), 100 pl CaCl 2 (1M), 400 pl IPTG (1M), 100 pl Ampicillina (100 mg / mL), 100 pl Tetraciclina (12,5 mg / mL in EtOH). Distribuire 75 microlitri di NGM a ciascun pozzetto di uno a 96 pozzetti a fondo piatto piatto. Per evitare la solidificazione del mezzo, deve essere erogato rapidamente, è conveniente utilizzare un erogatore ripetitivo (ad esempio Repeatman, Eppendorf). Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria presenti nei pozzetti. Conservare le piastre immediatamente in una camera umida (ad esempio una scatola Tupperware con tovaglioli di carta bagnati in basso) a 4 ° C. Nota: piastre possono essere preparati fino ad una settimana prima e conservato a 4 ° C, questo può rendere l'organizzazione delle fasi successive più facile. 2. Preparazione automatizzata dei 96 Deepwell piastre LB <li> Preparare e distribuire 1,5 mL LB contenente ampicillina e tetraciclina 100μg/mL 12,5 ug / mL in ciascun pozzetto della piastra di 96 Deepwell che ha una capacità massima di 2 mL / pozzetto. La distribuzione è migliorata tramite un sistema robotizzato di manipolazione dei liquidi (per esempio TECAN) ma può anche essere effettuata manualmente, se necessario. Aggiungi una copertura per ogni piatto e conservare a 4 ° C. Al fine di tenere traccia di ogni piastra a 96 pozzetti, un'etichetta univoca o codice a barre dovrebbe essere aggiunto in questa fase o successivamente. Nota: piastre possono essere preparati da 2 a 3 giorni di anticipo e conservati a 4 ° C, questo può rendere l'organizzazione delle fasi successive più facile. 3. Crescere i cloni RNAi batteriche nei 96 Deepwell piastre LB (cultura durante la notte) Per facilitare la successiva manipolazione, quando i cloni originali RNAi librerie sono a 384 pozzetti formato, prima ridistribuire i cloni in etichetta o codice a barre standard di piastre da 96 pozzetti contenenti LB con 100 pg / mL Amp e 12,5 ug / ml Tet integrato con glicerolo (10% concentrazione finale). Quando le lastre originali 384-e non hanno cloni in tutti i pozzetti, come avviene per i più comunemente impiegati libreria "Ahringer", ci sono diverse opzioni per organizzare le piastre figlie. I cloni possono essere ridistribuita in modo che non ci sono pozzi vuoti nelle piastre figlie. Ciò minimizza il numero di piastre di schermo. Idealmente, però, durante la replica, alcuni pozzi su ogni piatto figlia deve essere lasciata vuota, in modo che possano essere successivamente riempito con cloni di controllo standard (positivo e negativo) che facilitano in-piastra confronti. Queste piastre a 96 pozzetti figlia vengono quindi utilizzati per le sementi 96-Deepwell piastre LB per una notte (ON) cultura. Tutte le fasi di manipolazione di liquidi sono fatto meglio con un sistema robotizzato di manipolazione dei liquidi (per esempio Tecan), ma può essere eseguita manualmente usando, per esempio, un 96-pin replicatore. Se i cloni della libreria RNAi sono già in un formato a 96 pozzetti andare al punto 3.5. <ol start = "2"> Incubare le piastre a 96 pozzetti figlia RNAi a 37 ° C con agitazione (200 rpm) per 14-15 ore. Verificare che i batteri sono cresciuti correttamente e identificare i cloni che non crescono. Questi saranno esclusi dalle analisi successive. Idealmente, la OD 600 viene misurata in ciascun pozzetto, ma questo può essere fatto con la semplice ispezione. Conservare le piastre a 96 pozzetti figlia RNAi a -80 ° C prima dell'uso. Scongelare le piastre a 96 pozzetti contenenti il ​​cloni RNAi a temperatura ambiente. Le piastre possono essere poi tenuto a 4 ° C fino all'utilizzo. Distribuire 3 pl di ciascun clone batterica da una piastra a 96 pozzetti replicare ai pozzetti 96 della corrispondente etichetta / codice a barre 96-Deepwell piastra LB contenente 1,5 ml di LB con 100 pg / mL Amp e 12,5 ug / ml Tet. Cloni batterici per controllare l'efficienza RNAi, ad esempio un (RNAi) clone GFP nel presente esempio, e controlli negativi, possono essere incorporati in qualsiasi manualmente ben disponibile vuoto. Coprire il 96-Deepwell ptardive con una pellicola adesiva (es. film AeraSeal coltura cellulare da Dutscher). Sostituire la piastra a 96 pozzetti utilizzati replica a -80 ° C. Le piastre 96-Deepwell marcati vengono poi incubate ON a 37 ° C con agitazione (200 rpm per 14-15 ore). Giorno 2 4. Seed i cloni RNAi batteriche sui 96 e NGM piastre RNAi Questo passaggio dovrebbe essere fatto al mattino successivo alla cultura. Prendere le piastre a 96 pozzetti NGM da 4 ° C e lasciarli riscaldare ed essiccare per 5-15 min sotto un armadietto a flusso laminare sterile. Non lasciare le piastre troppo a lungo sotto il cofano (massimo 30 min), altrimenti il ​​NGM può successivamente incrinarsi. Aggiungere l'etichetta appropriata / codici a barre per ogni piatto. Recuperare il 96 Deepwell ON piastre di coltura da 37 ° C. Registrare le posizioni di eventuali pozzetti vuoti (un pozzo vuoto è completamente trasparente), che saranno esclusi dalle analisi successive. Centrifugare il 96-Deepwell piastre 5 min a 4000 rpm. Tamponare il surnatante ruotando la piastra capovolta bruscamente e asciugare i bordi della piastra rapidamente su un tovagliolo di carta. Come sono le culture di batteri ricombinanti, il surnatante deve essere trattata in conformità alla normativa vigente (ad es autoclavato). Risospendere il pellet batterico del liquido residuo (circa 50 mL) nel vortex, preferibilmente utilizzando un agitatore dedicato (per esempio Tecan) in modo che ciascuna piastra riceve esattamente lo stesso trattamento. È possibile misurare la OD 600 di ogni pozzetto per standardizzare precisamente l'inoculo batterico per la fase successiva, ma ciò non è indispensabile, e non eseguire tale controllo. Trasferire 5 pl della batteri risospeso sulle piastre a 96 pozzetti utilizzando un NGM 8 o 12-canali multi-pipetta. Fare attenzione a non toccare o penetrare la NGM. Questo passo viene eseguito manualmente, ma possono essere ottimizzati utilizzando un robot come il Liquidator96 (Rainin) che permettela distribuzione di 96 cloni RNAi in un solo passaggio. Lasciate che i batteri a secco sotto un armadietto sterile a flusso laminare, controllando regolarmente per evitare la NGM diventare troppo secca. Questo passaggio dovrebbe prendere circa 2 ore. Incubare a 96 pozzetti RNAi-NGM piastre a 37 ° C ON in una camera umida. 5. Preparare una popolazione di vermi sincronizzato Per questo passo, usiamo vermi transgeniche portanti il gene reporter (s) di interesse (ad esempio un'infezione-inducibile p nlp-29 :: GFP costrutto e, come controllo interno, costitutiva p col-12 :: DsRed transgene costrutto) . A causa della diminuzione osservata di espressione del transgene nel tempo, ci scongelare lotti fresche di vermi ogni 6 settimane. Noi vermi cultura per almeno 2 generazioni prima dell'uso, e garantire che i vermi non hanno mai fame prima del dosaggio. Se il giorno 2 del protocollo è il Martedì, ci prepariamo vermi su Venerdì 30 mettendo vermi adulti giovani su un piatto di 9 centimetri NGM diffuso con OP50 batteria 20 ° C, ma sarà pronto per candeggina il Martedì (vedi Tabella 1). Vermi Bleach seguito il protocollo standard 10. Lasciate che le uova si schiudono in M9 a 25 ° C ON con agitazione per ottenere una popolazione sincronizzata di larve L1. Giorno 3 6. Distribuire i vermi sui 96 pozzetti RNAi-NGM piastre per l'alimentazione e RNAi Questo passaggio dovrebbe essere fatto al mattino. Worm L1-stage sincronizzati sono distribuiti su ogni clone a 96 pozzetti batterica per nutrirsi e per RNAi. Recuperare i 96 e RNAi-NGM piastre da 37 ° C e lasciarle a temperatura ambiente per raffreddare. Recuperare i vermi sbiancati dal 25 ° C. Stimare il numero di vermi per 2 microlitri e regolare con M9 di avere circa 100-120 vermi ogni 2 pl (circa una goccia). Distribuire manualmente 2 microlitri di fase L1-vermi in ogni pozzetto usando un dispenser ripetitivo. Controllare ogni bene per i vermi (dovreste vedere i vermi che nuotano in liquido). Lasciare le piastre a secco sotto un armadietto a flusso laminare sterile (massimo 1 ora). Controllare regolarmente le piastre, i vermi devono essere strisciare e non nuotare. Attenzione, l'NGM non deve asciugare troppo, altrimenti si crepa. Porre le piastre a 25 ° C in una camera umida. 7. Testare le spore coniospora Drechmeria efficace per l'infezione da Questo passaggio è specifico per lo schermo attuale. Esso consiste nel testare diversi lotti di spore per selezionare quelli altamente infettivi. Pertanto, deve essere fatto il più vicino possibile prima giorno 4, il giorno di infezione. È necessario preparare sufficienti L3-L4 vermi in anticipo per questi test (Tabella 1). I metodi dettagliati, necessari per D. cultura coniospora sono state descritte altrove 11. <ol> Raccogliere spore da un campione di ciascuna cultura fungina in un piccolo volume di M9. Mettere una goccia di ogni sospensione di spore su un piatto NGM 35 millimetri seminato con OP50, e lasciarlo asciugare. Aggiungere 30-40 L3-L4 vermi che portano il gene reporter di interesse (ad esempio p nlp-29 :: GFP). Posizionare le piastre infetti a 25 ° C ON. Il giorno dopo, controllare i vermi per l'induzione GFP e selezionare il lotto di fungo che dà il più brillante, l'induzione più ampia e omogenea di fluorescenza verde. 4 ° giorno 8. Infettare il worm esposto RNAi con D. coniospora spore Questa operazione viene eseguita 30 ore dopo RNAi alimentazione quando vermi hanno raggiunto la L3-L4 stadio. Determinare il volume di spore di utilizzare per la distribuzione 4 pl per pozzetto. Raccogliere fresca D. spore coniospora dal batch selezionato con tampone M9. Uso 8-10 mL di M9 per una lastra 9 cm di spore. <li> Distribuisci 4 pl di spore ad ogni pozzetto con un dispenser ripetitivo. Controllare ogni bene per spore (si può vedere il nuoto vermi nel liquido). Lasciare asciugare le piastre sotto un armadietto sterile a flusso laminare (~ 1 ora). Controllare le piastre regolarmente fino ai vermi iniziare la scansione. Attenzione, l'NGM non deve asciugare troppo, altrimenti si crepa. Collocare le piastre infettate a 25 ° C in una camera umida. 5 ° giorno 9. Osservazione e stoccaggio delle piastre prima automatizzata analisi quantitativa Questo passaggio avvia 18 ore dopo l'infezione e viene eseguita nel giorno 5. Worms dovrebbero essere i giovani adulti iniziano a deporre le uova. Durante questa fase il fenotipo è segnato visivamente: sia vermi fluorescenza verde che corrisponde ad una situazione normale dopo infezione, o l'induzione di GFP è alterata in un ben determinato che significa che le variazioni del gene silenziato la risposta alle infezioni. <li> rapidamente osservare i piatti sotto il microscopio a fluorescenza dissezione. Se le piastre a induzione mostrano una buona GFP generale, quindi procedere alla fase successiva, altrimenti attendere fino al pomeriggio per una induzione migliore, finché c'è ancora cibo lasciato per i vermi. Visivamente segnare ogni piatto e annotare ogni bene con un fenotipo marcata (ad esempio non espressione della GFP). Controllando per i risultati ottenuti con i cloni RNAi di controllo che possono essere stati aggiunti, questa prima analisi preliminare offre l'indicazione se l'esperimento ha avuto successo. Utilizzando un 8 o 12 canali Multi pipetta di trasferimento i vermi con 100 microlitri di NaCl 50 mM, Triton 0,05%, corrispondente a una nuova etichetta / codice a barre a 96 pozzetti a fondo tondo piatto. Congelare le piastre a -80 ° C fino all'analisi. Il giorno dell'analisi, scongelare le piastre a temperatura ambiente e procedere all'analisi automatizzata utilizzando il Biosort COPAS. Il selezionatore analizza una singola lastra in 22 minuti. Le piastre non dovrebbe esserelasciato a temperatura ambiente per più di un'ora prima dell'analisi, e non possono essere congelati nuovamente. Le informazioni ottenute dal Biosort COPAS sono trascritti in un file di Excel per la verifica sommaria della qualità dei dati. I dati grezzi con i diversi parametri misurati dalla Biosort COPAS (densità ottica (estinzione), la lunghezza assiale (tempo di volo), le emissioni di fluorescenza, contemporaneamente da tre rivelatori diversi) vengono quindi memorizzate in un pacchetto dedicato LIMS (Mbio LIMS, Modul- Bio) per le successive analisi dettagliate quantitative. 10. Risultati rappresentativi Usando le quantità di vermi e batteri cui sopra, alla fine dell'esperimento, nella maggior parte dei pozzi, gli animali hanno sviluppato dovrebbero adulta e ci dovrebbe essere ancora qualche cibo lasciato in tutti i pozzetti. In queste condizioni, la maggior parte dei pozzetti dovrebbe anche contenere uova. Ci dovrebbe essere un numero sufficiente di adulti in ciascun pozzetto in modo che i dati sono ottenuti Biosort fo almeno 50 singoli vermi. D'altra parte, se la RNAi è efficiente, un gran numero di cloni RNAi provocherà un fenotipo visibile. Ad esempio, i vermi possono essere scoordinato, o più chiaramente, sterile, o arrestati nel loro sviluppo. Questo dovrebbe verificarsi di frequente, in modo che generalmente almeno un pozzetto per piastra da 96 pozzetti contiene vermi con un fenotipo evidente RNAi. Quando il fenotipo di interesse è l'espressione di un gene reporter GFP, pozzetti con un (RNAi) clone GFP fornire un controllo robusto (Fig. 2). Fenotipi Altri, come una modifica della dimensione può essere facilmente misurata con il Biosort (Fig. 3A). Abbiamo osservato che i vermi potrebbero migrare verso pozzetti adiacenti a frequenza molto bassa (<1%, BS, risultati non pubblicati) quando il cibo in un pozzo ha esaurito. Abbattendo la funzione di differenti classi di geni che possono influenzare l'espressione transgeni in C. elegans. Alcuni sono non specificamente richiesto per l'espressione transgeni 12. Altri, comecome tessuto-specifici fattori di trascrizione, per esempio il fattore GATA epidermico ELT-3 13, sarà richiesto in particolare sottoinsiemi di cellule. Questo è uno dei motivi per l'inserimento di un non-correlata e costitutiva epidermica costrutto reporter di cella transgene (p col-12 :: DsRed) nel ceppo utilizzato per il protocollo corrente. Questo consente di tali geni di essere distinte da quelle specificamente coinvolti nel processo di gene regolatore in studio (Fig. 3B & C). Il transgene è espresso durante tutti gli stadi larvali. Se un test implica l'espressione genica in embrioni rilevare un diverso gene reporter controllo sarebbe necessaria. Una delle innovazioni di questo protocollo è l'uso di piastre di congelamento di rinviare la loro analisi. Le piastre di congelamento permette di essere conservati per un massimo di due settimane senza alterare sostanzialmente i risultati. Sebbene i valori assoluti di fluorescenza misurata può essere cambiato, le percentuali relative rimangono simili (Fig. 4). Sul otla sua mano, RNAi è un 14 intrinsecamente variabile procedura sperimentale. Per ottenere risultati robusti ed eliminare i molti potenziali falsi positivi, schermi RNAi è necessario replicare, almeno una volta. Se gli esperimenti sono condotti con successo, ci dovrebbe essere una correlazione ragionevole tra i risultati di una piastra testato in giorni diversi. In particolare, i geni che hanno un forte effetto dovrebbe essere chiaramente identificabili, anche se il loro effetto preciso quantitativo non è identica tra le piastre duplicati (Fig. 5). Figura 1. Schema generale per un esperimento tipico. Figura 2. RNAi di controllo utilizzando un clone di mira l'espressione della GFP. Transgenico vermi espressivong costitutivamente ap col-12 :: DsRed giornalista e un inducibile p nlp 29 :: reporter GFP su terreno solido in una piastra a 96 pozzetti visualizzati utilizzando un microscopio a dissezione GFP con filtro che consente l'osservazione simultanea di fluorescenza rossa e verde. Worms sono stati esposti a controllare (pannelli superiori) o un GFP RNAi clone (pannelli inferiori) per 48 h. I pannelli a sinistra sono vermi infetti, quelli sui vermi giusto 18 ore dopo l'infezione con il D. coniospora. La barra della scala è di 1 mm. Figura 3. L'analisi quantitativa di una piastra a 96 pozzetti. Il Biosort COPAS genera dati numerici per ogni verme analizzati. I grafici mostrano la deviazione media e standard per il tempo di volo (TOF; A) che corrisponde alla dimensione del vermi 15, fluorescenza rossa (B) e il rapporto (X100) di fluorescenza verde TOF (C) di transgenica worms esprimono costitutivamente col AP-12 :: giornalista DsRed e uno inducibile p nlp 29 :: reporter GFP che erano stati coltivati ​​su mezzo solido in una piastra a 96 pozzetti con differenti cloni RNAi per 48 ore, 18 ore dopo l'infezione con D. coniospora. Alcuni cloni, come quella evidenziata con la freccia in (A), provocano difetti di crescita e / o influenzare l'espressione di p col-12 :: DsRed. Altri, in particolare influenzano l'espressione della GFP, come evidenziato dalla freccia in (C). Questo particolare clone bersaglia il nsy gene 1, in precedenza dimostrato di essere importante per la regolazione della PNL 29 13. Green, fluorescenza rossa e TOF vengono misurate in unità arbitrarie, ma costante. Figura 4. CompArison dei dati ottenuti con campioni dal vivo e congelato lo stesso esperimento. Lastre di L4 vermi che trasportano p nlp-29 :: GFP e col p-12 :: transgeni DsRed sono stati o infettati con D. coniospora o non. Dopo 18h, ogni piastra è stata divisa in 2; metà è stata analizzata immediatamente e mezzo congelato a -80 ° C per 24 ore, prima che lo scongelamento e di analisi. I valori di media TOF (dimensione dei vermi), EXT (densità ottica) e la fluorescenza verde e rosso sono stati calcolati per ogni campione. Il grafico mostra il rapporto della media infettato diviso non infette campioni, per i campioni congelati e vivo (n = 7638 e 5096, e 8634 e 3850 vermi, rispettivamente). Figura 5. L'analisi comparativa dei duplicati piastre da 96 pozzetti. Il rapporto di fluorescenza normalizzato (il rapporto di fluorescenza media (qui, 100 * verde / TOF) per ciascun pozzetto divisola tagliata (25 ° al 75 ° percentile), si intendono per ogni piastra) per ogni bene da analisi duplicate di un rappresentante della piastra a 96 pozzetti. Materiale Timeline Sperimentale IPTG: ~ 1,4 mL Ampicillina: ~ 5 mL Tetraciclina: ~ 5 mL LB: 5 L 96-pozzetti piane: 30 per NGM Piastre tonde a 96 pozzetti: 30 per il congelamento (analisi) 96-Deepwell piastre: 30 per la cultura ON cultura cinematografica: 30 Suggerimenti per scatola: 30 per la semina dei batteri 9 cm OP50 piastre: ~ 17 Worms: 1 appena scongelato cyrovial al mese Spore: ~ 2 piastre NaCl 50 mM + 0,05% Triton: ~ 300 mL Giovedi Preparare la RNAi NGM piastre a 96 pozzetti (~ 1h + autoclave) Venerdì Preparare i piatti LB 96-Deepwell (~ 4h) Preparare i vermi piatti (14 con 30 vermi adulti giovani a 20 ° C + 1 piatto a 25 ° C) Lunedi Trasferire i vermi dalla piastra a 25 ° C sulla nuova piastra Distribuire i batteri in piastre LB (~ 7h) Sulla cultura in 6:00 Martedì Distribuire i batteri su piastre NGM al mattino (~ 3h+ 2h ~~~HEAD=NNS asciugatura) Bleach vermi da piastre a 20 ° C Mercoledì Distribuire i vermi alle ore 10 (~ 1h + 1h ~~~HEAD=NNS asciugatura) Spore di prova con i vermi dalla piastra a 25 ° C Giovedi Infect vermi alle 3 pm (~ 1h + 1h ~~~HEAD=NNS asciugatura) Venerdì Trasferimento in piastre da 96 pozzetti + freeze (~ 2h) nuovo Tabella 1. Esempio di un ciclo esperimento con 30 piatti. Qui viene presentato il materiale necessario per un ciclo unico esperimento di 30 piatti e un calendario per un esperimento dal punto 1 al punto 12 organizzato su 9 giorni. Nematodi media di crescita (NGM), 100 ml: 0.3 g NaCl 0,25 g BactoPeptone 2 g BactoAgar 100 pl 5 mg / mL di colesterolo in EtOH Aggiungere acqua deionizzata a 100 mL Autoclave per 5 minuti a 121 ° C e lasciate raffreddare, quindi aggiungere: 100 pl 1 M MgSO 4 100 pl 1 M CaCl 2 2,5 mL 1 M KPO 4 pH 6,0 NGM per il trattamento RNAi in piastra a 96 pozzetti, 100 mL: 0,29 g NaCl 0,25 g BactoPeptone 1,7 g BactoAgar 100 pl 5 mg / mL di colesterolo in EtOH Aggiungi de acqua deionizzata a 100 mL Autoclave per 5 minuti a 121 ° C e lasciate raffreddare, quindi aggiungere: 100 pl 1 M MgSO 4 100 pl 1 M CaCl 2 2,5 mL 1 M KPO 4 pH 6,0 400 microlitri 1 M IPTG 100 pl 100 mg / ml di ampicillina 100 pl 12,5 mg / mL Tetracycline Bleach soluzione, 5 ml: 2,5 mL H 2 O 2,3 mL Bleach 0,2 mL di NaOH 50% NaOH 50%, 100 mL: 50 g NaOH Aggiungere acqua deionizzata a 100 mL NaCl 50mM-Triton 0,05%, 400 ml: 4 mL NaCl 5 M 1 ml di Triton 20% Aggiungere acqua deionizzata a 400 mL tep "> Triton 20%, 10 mL: 2 mL Triton X-100 8 mL di acqua deionizzata M9 tampone, 1L 6 g Na 2 HPO 4 (MW: 178) 3 g di KH 2 PO 4 (PM: 136) 5 g NaCl Aggiungere acqua deionizzata a 1 L Autoclavare Aggiungere 1 mL di MgSO 4 1 M Luria Broth (LB), 1L: 10 g BactoTryptone 20 g Estratto di lievito 10 g di NaCl Aggiungere acqua deionizzata a 1 L Autoclavare 1 M MgSO 4, 300 mL: 73,95 g MgSO 4 Aggiungere acqua deionizzata a 300 mL Autoclave e conservare a temperatura ambiente 5 mg / Colesterolo mL, 200 mL: 1 g Colesterolo Aggiungere 100% EtOH a 200 mL Filtrare sterilizzare e conservare a temperatura ambiente 1 M CaCl 2, 500 mL: 27.75 g di CaCl 2 Aggiungere acqua deionizzata a 500 mL Filtrare sterilizzare e conservare a temperatura ambiente 1 M KPO 4 pH 6,0, 4 L: 517 g KH 2 PO 4 (PM: 136) 207 g K 2 HPO 4 (MW: 174) Aggiungere acqua deionizzata a 4 L 100 mg / ml di ampicillina (Amp), 10 mL: 1 g ampicillina Aggiungere acqua deionizzata a 10 mL Conservare a -20 ° C 1 M isopropil β-D-tiogalattopiranoside (IPTG), 10 mL: 2,38 g IPTG Aggiungere acqua deionizzata a 10 mL Conservare a -20 ° C 12,5 mg / ml di tetraciclina, 100 mL 1,25 g Tetracycline Aggiungere 100% di EtOH 100 ml Tabella 2. Solutions.