の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

後述するようにプロトコルは、5日間連続した（図1）の手順に分かれています。前述のように、特定の手順は、別の日に行うことができます。各ステップの期間と同様に、必要な材料の量は、（例えば、ワーム、バクテリア、メディア）は、実験ごとに処理された96ウェルプレートの数に依存します。 1日目 1。 96ウェルNGMのRNAiプレートの準備次のプロトコルは、さまざまなソリューションのための殺菌技術の詳細を含む10ワーム培養プレートを作るための標準的な方法から構成されている。 1.7グラムBactoAgar、0.29グラムのNaCl、0.25グラムペプトン、100μLコレステロール（EtOH中5 mg / mLの）：10-12、96ウェルプレートの場合は、脱イオンH 2 Oで線虫の増殖培地100 mLの（NGM）を準備します。 オートクレーブNGM（121℃で5分間C 100 mLに対して、121℃で30分間4 LのC）は約50°C（単にクールENOになるまで、そしてそれが冷ます）を保持するためにぐふっ。それはNGMは、それが固化しないように十分に暖かいとどまることが重要です。 100mLのために追加：2.5 mLのリン酸緩衝液pH6で（1M）、100μLのMgSO 4（1M）、100μLのCaCl 2（1M）、400μLIPTG（1M）、100μLアンピシリン（100 mg / mL）は、100μLテトラサイクリン（エタノール12.5 mg / mL）を。 96ウェル平底プレートの各ウェルにNGMの75μLを配布します。媒体の凝固を避けるために、それが急速に分配する必要があり、それは反復的なディスペンサー（例えばRepeatman、エッペンドルフ）を使用すると便利です。井戸の中に存在しない空気の泡が存在しないことを確認してください。 4℃で多湿の室（例えば、下部に濡れたペーパータオルでタッパーウェアボックス）ですぐにプレートを保存注：プレートを事前に週まで準備し、4℃で保存することができます°C、これは以降の手順の組織が容易になります。 2。 96ディープウェルのLBプレートの自動作成<l私は>100μg/mlのアンピシリンおよび2 mL /ウェルの最大容量を持つ96ディープウェルプレートの各ウェルにテトラサイクリン12.5μg/ mLのを含む1.5 mLのLBを準備し、配布しています。ディストリビューションは、ロボット液体ハンドリングシステム（例えば、TECAN）を使用して最適化されているだけでなく、必要に応じて手動で実行することができます。 4℃で各プレートや店舗にカバーを追加します。各96ウェルプレートを追跡するためには、ユニークなラベルやバーコードは、この段階で、またはその後、追加する必要があります。 注：プレートは、事前に2〜3日を調製し、4℃で保存することができます°C、これは以降の手順の組織が容易になります。 3。 96ディープウェルのLBプレート（一晩培養）におけるRNAi細菌クローンを育てるオリジナルのRNAiライブラリークローンは384ウェルフォーマットは、最初の配布ラベルにクローンまたは100μg/ mLのアンプおよび12.5μg/ mLでTとLBを含むバーコード標準的な96ウェルプレートである処理の後続の使いやすさ、のためにらは、グリセロール（10％最終濃度）を添加した。オリジナルの384ウェルプレートは、全てのウェルのクローンを持っていない場合は、最も一般的に使用される "Ahringer"ライブラリの場合と同様、ドータープレートを整理するためのいくつかのオプションがあります。クローンは、娘板には空の井戸が存在しないように再配布することができます。この画面にプレートの数を最小限に抑えることができます。理想的には、しかしながら、複製時に、それぞれの娘のプレートには、いくつかの井戸が、これらはその後、全体のプレートの比較を容易にする標準的な制御クローン（正および負）を充填することができるように、空のままにする必要があります。これらの96ウェルの娘次いで、プレートを一晩（ON）文化のための種子を96ディープウェルのLBプレートに使用されます。 すべての液体処理ステップは最高のロボット液体ハンドリングシステム（例えば、テカン）で行われていますが、使用して手動で実行することができ、例えば、96ピンレプリケーター。 RNAiライブラリーのクローンを96ウェルフォーマットで既にある場合は3.5に進みます。 <olスタート= "2"> 37℃14〜15時間攪拌（200rpm）したCで96ウェルのRNAi娘プレートをインキュベートします。 バクテリアが正常に成長していることを確認して、成長しなかったクローンを識別します。これらは、後の分析から除外されます。理想的には、OD 600を各ウェルで測定されますが、これは簡単な検査によって行うことができます。 °C使用前に-80℃で96ウェルのRNAi娘プレートを保管してください。 室温でのRNAiクローンを含む96ウェルプレートを解凍します。次いで、プレートを°C使用時まで4℃で保存することができます。 96、100μg/ mLのアンプおよび12.5μg/ mLのテトとLBの1.5 mLを含むそれに応じてラベル/バーコード96ディープウェルのLBプレートの96ウェルプレートを複製するから各細菌クローンの3μLを配布します。このような本実施例におけるGFP（RNAi）をクローンとしてのRNAiの効率を制御する細菌クローン、およびネガティブコントロールは、任意の使用可能な空の井戸に手動で組み込むことができます。 96ディープウェルpをカバー接着フィルム（Dutscherから例AeraSeal細胞培養フィルム）と设置。 -80℃で使用し、96ウェルプレートの複製℃を置き換える 96ディープウェルプレートを標識した後37℃でインキュベートされてい°Cで撹拌しながら（14〜15時間、200 rpm）で。 2日目 4。 96ウェルNGMのRNAiプレートにシードRNAiの細菌クローンをこの手順は、ON培養後、午前中に行われる必要があります。 4から96ウェルNGMプレートを取る°C、それらを無菌層流キャビネットの下に5〜15分間ウォームアップし、乾燥しましょう​​。そうでなければNGMその後割れる可能性があるので、長すぎるフード（最大30分）の下に板を放置しないでください。各プレートに適切なラベル/バーコードを追加します。 37℃から培養プレート上で96ディープウェルを取得します。任意の空井戸（空井戸が完全に透明である）の位置を記録し、これらは以降の分析から除外されます。 96遠心分離·ディープウェルプレートを4000rpmで5分。 逆さまに急激に板を回して、上清から転倒し、ペーパータオル上で急速にプレートの端を乾燥させます。文化は組換え細菌であるように、上清は地域の規制（例えば、オートクレーブ処理したもの）に従って処理する必要があります。 各プレートは正確に同じ治療を受けるように理想的には、専用の攪拌器（例えば、テカン）を使用して、ボルテックスで残液（約50μL）の細菌ペレットを再懸濁します。それは正確に次のステップのために細菌の接種を標準化するために各ウェルのOD 600を測定することが可能ですが、これは必須ではありません、我々はそのようなチェックを実行しないでください。 8または12チャンネルマルチピペットを用いて96ウェルNGMプレートに再懸濁した細菌の5μLを転送します。 NGMに触れたり、浸透しないように注意してください。このステップを手動で実行されていますが、そのようなことができますLiquidator96（レイニン）などのロボットを使用して最適化することができますワンステップで96のRNAiクローンのディストリビューション。 NGMが乾燥しすぎてなることを避けるために定期的にチェックし、無菌層流キャビネットの下の細菌は乾燥させます。このステップでは、約2時間を取る必要があります。 湿ったチャンバー内で37℃で96ウェルのRNAi-NGMプレートをインキュベートします。 5。ワームの同期人口を準備します。 このステップでは、我々は、関心のあるレポーター遺伝子（s）を（感染誘導性のp NLP-29 :: GFPコンストラクトを、例えばと、内部コントロールとして、構成的なP COL-12 :: DsRedをトランスジーンコンストラクト）トランスジェニックのワームを使用。ので、時間とともに導入遺伝子の発現の観測減少から、我々は、ワーム、6週間ごとの新鮮なバッチを解凍します。我々は、使用前に少なくとも2世代の文化ワーム、ワームは、アッセイ前に餓死したことがないことを確認してください。プロトコルの2日目が火曜日の場合は、我々は、OP50細菌で広がる9cmのNGMプレート上で30若い成人ワームを配置することによって、金曜日にワームを準備（20℃）、彼らは火曜日の漂白剤（表1を参照）できるようになります。 標準プロトコル10次の漂白剤のワーム。 卵L1幼虫の同期人口を取得するために攪拌しながら25℃でM9で孵化しましょう​​。 3日目 6。給餌とRNAiのための96ウェルのRNAi-NGMプレート上にワームを配布この手順は、午前中に行われる必要があります。 L1-ステージ同期ワームは餌とRNAiのための各96ウェル細菌のクローンに分散されています。 37°Cから96ウェルのRNAi-NGMプレートを取得し、冷却し、室温のままにします。 25℃から漂白されたワームを取得します。 2μLあたりのワームの数を見積もると2μLあたり約100から120までのワームを（およそ一滴）を持っているM9で調整します。 手動で反復的なディスペンサーを用いて各ウェル中のL1段ワームの2μLを配布します。ワームの各ウェルを確認してください（あなたが液体の中を泳いでワームを参照する必要があります）。 無菌層流キャビネット（最大1時間）の下にプレートは乾燥させます。定期的にプレートをチェックします。ワームは、クロールや水泳ませんする必要があります。慎重に、NGMは、それ以外の場合はクラックされ、あまりにも乾燥してはいけません。 湿ったチャンバー内で25℃でプレートを配置します。 7。効果的な感染Drechmeria coniospora胞子をテストします。 このステップでは、現在の画面に固有のものです。それは非常に感染性のものを選択して胞子の異なるバッチのテストで構成されています。したがって、それは4日、感染症の日前にできるだけ近く行われる必要があります。それはこれらのテスト（表1）を事前に十分なL3-L4ワームを準備する必要があります。 D.するために必要な詳細な方法coniospora文化は他の11に記載されている。 <OL> M9の小さなボリューム内の各真菌培養のサンプルから胞子を収集します。 OP50を接種した35 mmのNGMプレート上の各胞子懸濁液のドロップを置いて、乾燥させます。 興味のあるレポーター遺伝子を運ぶ30から40、L3-L4ワーム（例えば、p NLP-29 :: GFP）を追加します。 25℃で感染したプレートを配置します。 翌日、GFPの誘導のためにワームをチェックし、緑色蛍光の明るい、最も広範かつ均質な誘導を与える菌のバッチを選択します。 4日目 8。 D.とRNAiを露出したワームに感染coniospora胞子 ワームは、L3-L4の段階に達したときに、このステップは、30時間RNAiの給餌後に実行されます。 ウェルあたり4μLを配布するために使用する胞子の量を決定します。 新鮮な収集D. M9バッファーで選択したバッチからconiospora胞子 。胞子の1つの9 cmのプレートでM9の8-10 mLを使用しています。 <LI>反復的なディスペンサーを各ウェルに胞子の4μLを配布します。胞子のために各ウェルを確認してください（あなたが液体の中を泳いでワームを見ることができます）。 無菌層流キャビネット（〜1時間）の下にプレートは乾燥させます。ワームは、クロールを開始するまで定期的にプレートを確認してください。慎重に、NGMは、それ以外の場合はクラックされ、あまりにも乾燥してはいけません。 湿ったチャンバー内で25℃で感染したプレート°Cを配置します。 5日目 9。自動化された定量分析の前にプレートの観察とストレージこのステップでは、感染後18時間を開始し、5日中に実行されます。ワームは卵を産み始めた若い成人であることが期待されています。このステップの間に表現型は、視覚的に得点されています。どちらのワームは、通常の状況は、次の感染症に対応する緑色の蛍光を発する、またはGFPの誘導は沈黙遺伝子は、感染に対する応答を変更することを意味します与えられた井戸に変更されます。 <Liが>急速に蛍光解剖顕微鏡下でプレートを観察します。プレートは優れた一般的なGFPの誘導を示す場合は、次のステップに進み、そうでない限り、ワーム放置食べ物が残っているとして、より良い誘導のために午後まで待機します。 視覚的には、すべてのプレートを獲得し、顕著な表現型（GFPは発現しないなど）で任意の整形に注意してください。追加されている可能性があり、任意のコントロールRNAiのクローンで得られた結果をチェックして、この最初の予備的な分析は、実験が成功したかどうかの指標を与える。 には、NaClの50mM-トリトン0.05％の100μLで8または12チャンネルマルチピペット転送のワームを使用して、新しいそれに応じてラベル/ 96ウェル丸底プレートバーコード。分析まで-80℃でプレートを固定します。 分析の日に、室温でプレートを解凍し、COPAS Biosortを使用して自動分析に進みます。ソーターは22分に単板を分析します。プレートはすべきではない分析の前に一時間以上室温で放置し、それらを再び凍結することはできません。 COPAS Biosortから得られる情報は、データの品質の大まかな検証用のExcelファイルに転写されています。 COPAS Biosort（3つの異なる検出器によって同時に光学密度（吸光）、軸方向の長さ（飛行時間）、蛍光発光、）で測定し、異なるパラメータを持つ生データは、その後、専用のLIMSパッケージ（MBio LIMSに格納されています。MODUL-その後の詳細な定量分析のためのバイオ）。 10。代表的な結果ほとんどのウェルに、実験の最後に、上記のワームや細菌の量を使用して、動物は、すべての成人に開発している必要があり、まだ全てのウェルに残っていくつかの食品があるはずです。これらの条件下では、ほとんどの井戸がまた卵を含んでいる必要があります。よくそうBiosortデータはfを得られることをそれぞれの成人の十分な数があるはずまたは少なくとも50個のワーム。 RNAiは、効率的な場合一方、RNAiのクローンの多くは目に見える表現型を引き起こします。たとえば、ワームは、まとまりのない、またはそれ以上の明らかに、滅菌、またはそれらの開発で逮捕されたかもしれません。これは一般的に96ウェルプレートごとに少なくとも1つが明白なRNAi表現型ワームが含まれていますので、頻繁に発生する必要があります。関心の表現型は、GFPレポーター遺伝子の発現である場合、GFP（RNAi）をクローンした井戸はロバスト制御（図2）を提供します。このような大きさの変更など、その他の表現型は、容易にBiosort（図3A）で測定することができます。我々は井の中の食べ物が不足しなかったときにワームが非常に低い周波数（<1％、BS、未発表の結果）で、隣接するウェルに移行することができることを観察した。 遺伝子の異なるクラスの機能をノックダウンすると、Cの導入遺伝子の発現に影響を与える可能性がエレガンス 。いくつかは、非特異的組換え遺伝子の発現12に必要とされる。その他、このような組織特異的転写因子として、例えば、表皮GATA因子ELT-3 13は 、細胞の特定のサブセットに必要となります。これは、現在のプロトコルに使用する菌株の非関連および構成表皮細胞遺伝子レポーターコンストラクト（P COL-12 :: DsRed）を含めることの理由の一つです。これは、このような遺伝子が特異的に研究対象の遺伝子の規制プロセス（図3B＆C）に関与するものと区別することができます。この遺伝子は、すべての幼虫の段階で表されます。アッセイは、胚で検出する遺伝子発現を伴う場合は、別のコントロールレポーター遺伝子が必要になります。 このプロトコルの技術革新の一つは、彼らの分析を延期する凍結プレートの使用です。凍結は、プレートが実質的に結果を変更せずに二週間にするため、最大保存することができます。測定した蛍光の絶対値が変更される場合がありますが、それらの相対的な比率は、（図4）類似したままになります。 OTで彼女の手、RNAiは、本質的に可変実験手順14である。堅牢な結果を取得し、多くの潜在的な偽陽性を排除するために、RNAiスクリーニングでは、少なくとも一度は、レプリケートする必要があります。実験が成功し実施されている場合は、別の日にテストを1プレートからの結果の間の合理的な相関関係があるはずです。特に、強力な効果を持つ遺伝子は、それらの正確な定量的な効果は重複したプレート（図5）間で同一でない場合でも、明確に識別可能でなければなりません。 図1典型的な実験のための全体的なスキーム。 図2。GFP発現を標的クローンを用いてRNAiを制御します 。トランスジェニックワームexpressi96ウェルプレートに固形培地上でngの恒常AP COL-12 :: DsRedをレポーターおよび誘導P NLP 29 :: GFPレポーターは、赤と緑色蛍光の同時観察を可能にするフィルタが設定された顕微鏡解剖GFPを用いて可視化。ワームは、コントロール（上部パネル）または48時間GFP RNAiのクローン（下パネル）にさらされた。左側のパネルには、18時間D.感染した後に感染していないワーム、右のワームに関するものであるconiospora。スケールバーは1mmである。 図3。 96ウェルプレートの定量分析 。 COPAS Biosortは、分析ごとにワームの数値データを生成します。ワームは15のサイズは、赤色蛍光（B）およびトランスジェニックWOのTOFに緑色蛍光の比（X100）（C）に対応しています。グラフでは、飛行時間（TOF）の平均と標準偏差を示すRMSは、恒常的に発現しているAP COL-12 :: DsRedをレポーターおよび誘導P NLP 29 :: 18時間D.感染48時間後に別のRNAiのクローンを96ウェルプレートに固形培地上で培養されたGFPレポーター、 coniospora。このように矢印（）で強調1、挑発の成長欠陥および/ ​​またはp COL-12の発現に影響を及ぼす:: DsRedタンパク質などの特定のクローン。 （C）に矢印で強調されているように他のものは、具体的には、GFPの発現に影響を​​与えます。この特定のクローンは以前にNLP 29 13の調節に重要であることが示さ遺伝子NSY 1を対象としています。緑色、赤色蛍光とTOFは任意ですが、定数の単位で測定されます。 図4。コンプ同じ実験から、ライブと凍結サンプルで得られたデータのアリソン。 P NLP-29 :: GFPとp COL-12 :: DsRedを導入遺伝子を運ぶL4ワームのプレートはどちらD.に感染していたconiosporaかどうか。 18時間後、各プレートは約2に分割された。半分はすぐに分析し、解凍し、分析する前に半分、24時間-80℃で凍結した。平均TOF（ワームのサイズ）、EXT（光学密度）と、緑と赤の蛍光の値は、各サンプルについて計算した。グラフは、冷凍やライブサンプル（それぞれn = 7638と5096、および8634と3850、ワーム、）は、非感染サンプルで割った感染の平均の割合を示しています。 図5。重複した96ウェルプレートの比較分析 。各ウェルで割った正規化蛍光比（平均蛍光比（ここでは、100 *緑/ TOF）代表的な96ウェルプレートの重複した解析から、各ウェルについて（ 第 25〜75 パーセンタイル ）を各プレートの平均）トリミングされた。 材料 実験的なタイムライン IPTG：〜1.4 mLの アンピシリン：〜5 mLを テトラサイクリン：〜5 mLを LB：5 L 96ウェルフラットプレート：NGM 30 96ウェル丸プレート：凍結用の30（分析） 96ディープウェルプレート：文化ON 30 文化映画：30 ヒントボックス：細菌の播種30 9センチメートルOP50プレート：〜17 ワーム：1新たに融解cyrovial月額 胞子：〜2プレート 50mMの塩化ナトリウム+トリトン0.05パーセント〜300 mLの 木曜日 NGM RNAiは96ウェルプレート（〜1H +オートクレーブ）を準備 金曜日 96ディープウェルのLBプレート（〜4H）を準備ワーム（30若い成虫では14のプレート20〜25℃+ 1プレート°C）の準備 月曜日 新しいプレートに25℃でプレートからワームを転送 LBプレート（〜7H）の細菌を配布午後6時文化ON 火曜日 朝のNGMプレート上に細菌を配布（〜3H+〜2H乾燥） 20℃でプレートから漂白剤のワーム 水曜日 午前10時（〜1H +〜1時間乾燥）でワームを配布 25プレートからワームを使用してテスト胞子°C 木曜日 午後3時（〜1H +〜1時間乾燥）でワームに感染 金曜日 新しい96ウェルプレート+凍結（〜2H）の転送 表1に30プレートを1サイクル実験の例。 ここに30枚の1サイクルの実験と9日に開催、ステップ12にステップ1から実験のためのタイムラインに必要な材料を提示しています。 線虫の増殖培地（NGM）、100 mLの： 0。3グラム NaClを 0.25グラムバクトペプトン 2グラム BactoAgar 100μL EtOH中5 mg / mLのコレステロール 100mLに脱イオン水を追加します。 121°Cと冷ましで5分間オートクレーブしてから、追加します。 100μL 1 M MgSO 4で 100μL 1 M CaCl 2を 2.5mLの 1 M KPO 4 pH6.0の 96ウェルプレート、100 mL中のRNAi治療のためにNGM： 0.29グラム NaClを 0.25グラムバクトペプトン 1.7グラム BactoAgar 100μL EtOH中5 mg / mLのコレステロールドを追加します。脱イオン水100 mLを 121°Cと冷ましで5分間オートクレーブしてから、追加します。 100μL 1 M MgSO 4で 100μL 1 M CaCl 2を 2.5mLの 1 M KPO 4 pH6.0の 400μL 1 M IPTG 100μL は100 mg / mlのアンピシリン 100μL 12.5 mg / mLのテトラサイクリン漂白剤溶液を、5mLの： 2.5mLのH 2 O 2.3 mLのブリーチ 0.2mLのNaOHを50パーセント水酸化ナトリウム50％、100 mLの： 50グラムのNaOH 100mLに脱イオン水を追加します。 NaClで50mMのトリトン-0.05％、400 mLの： 4 mLの5 M NaClを 1 mLのトリトン20パーセント 400 mlに脱イオン水を追加します。 TEP ">トリトン20％、10 ML： 2 mLのトリトンX-100 8 mLの脱イオン水 M9バッファー、1L 6グラムのNa 2 HPO 4（MW：178） 3グラムのKH 2 PO 4（MW：136） 5gのNaCl 1 Lの脱イオン水を追加します。 オートクレーブ 1 mLのMgSO 4を 1 Mを追加します。 ルリア培地（LB）、1L： 10グラムリプトン 20gの酵母エキス 10グラムのNaCl 1 Lの脱イオン水を追加します。 オートクレーブ 1 M MgSO 4で 、300 mLの： 73.95グラムのMgSO 4 300mLに脱イオン水を追加します。 室温でオートクレーブや店舗 5 mg / mLのコレステロール、200mLの： 1グラムコレステロール 200mLに100％EtOHを追加する滅菌フィルタを適用し、室温で保存する 1 M CaCl 2を 、500 mLの： 27。75グラムのCaCl 2 500mLに脱イオン水を追加します。 滅菌フィルタを適用し、室温で保存する 1 M KPO 4 pH6.0で、4 L： 517グラムのKH 2 PO 4（MW：136） 207グラムK 2 HPO 4（MW：174） 4 Lに脱イオン水を追加します。 は100 mg / mLのアンピシリン（Amp）、10 mLの： 1グラムアンピシリン 10mLに脱イオン水を追加します。 -20℃で保存 1 Mイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）、10 mLの： 2.38グラムIPTG 10mLに脱イオン水を追加します。 -20℃で保存 12.5 mg / mLのテトラサイクリン、100 mLの 1.25グラムテトラサイクリン 100 mLに100％EtOHを追加する 表2。ソリューション。