Количественные и автоматизированных высокой пропускной генома RNAi экраны в С. Элеганс</em

Протокол, как описано ниже делится на шаги по пяти последовательных дней (рис. 1). Как уже отмечалось, некоторые шаги можно сделать в разные дни. Продолжительность каждого этапа, а также количество материала, необходимое (например, червей, бактерий, средства массовой информации) будет зависеть от числа 96 пластин рассматривается в эксперименте. День 1 1. Подготовка к 96-луночного NGM пластин RNAi Следующий протокол взято из стандартного метода для изготовления пластин червь культуры 10, который включает сведения о методах стерилизации различных решений. В 10-12 96-луночных планшетах, подготовить 100 мл СМИ нематода роста (НГО) в деионизированной H 2 O: 1,7 г BactoAgar, 0,29 г NaCl, 0,25 г Пептон, 100 мкл холестерина (5 мг / мл в этаноле). Автоклав NGM (5 мин при температуре 121 ° С в течение 100 мл, 30 мин при температуре 121 ° С в течение 4 л) и дайте ему остыть, пока он находится на уровне около 50 ° C (просто здорово Инотьфу провести). Важно, что НГО остается достаточно теплой, чтобы не затвердеть. Добавить 100 мл: 2,5 мл фосфатный буфер pH6 (1M), 100 мкл MgSO 4 (1M), 100 мкл CaCl 2 (1M), 400 мкл IPTG (1M), 100 мкл ампициллин (100 мг / мл), 100 мкл Тетрациклин (12,5 мг / мл в этаноле). Распределить 75 мкл NGM в каждую лунку 96-луночного плоским дном тарелку. Для того чтобы избежать затвердевания среды, она должна подаваться быстро, удобно использовать повторяющиеся дозатором (например, Repeatman, Eppendorf). Будьте уверены, что нет пузырьков воздуха присутствует в скважинах. Храните пластины сразу во влажной камере (например, окно Tupperware мокрыми полотенцами бумаги внизу) при 4 ° C. Примечание: пластины могут быть подготовлены до недели заранее и хранить при температуре 4 ° C, что может сделать организация последующих шагов легче. 2. Автоматизированная подготовка 96-Deepwell пластин LB <lя> Подготовка и распространение 1,5 мл LB, содержащей ампициллин и тетрациклин 100μg/mL 12,5 мкг / мл в каждую лунку 96-Deepwell пластина, которая имеет максимальную емкость 2 мл / лунку. Распределение оптимизирован с помощью робота жидкостной системой обработки (например, Tecan), но также может быть выполнена вручную, если это необходимо. Добавить обложки для каждой пластины и хранить при температуре 4 ° C. Для того, чтобы отслеживать каждый 96-луночного планшета, уникальной этикеткой или штрих-кода должна быть добавлена, на данном этапе и в дальнейшем. Примечание: плиты можно приготовить от 2 до 3 дней и хранить при температуре 4 ° C, что может сделать организация последующих шагов легче. 3. Рост RNAi бактериальных клонов в 96-Deepwell LB пластин (ночной культуры) Для дальнейшего удобства обработки, когда исходная RNAi библиотеки клонов находится в 384-и формат, в первую распространять клонов в помечены или штрих-код стандартных 96-луночных содержащих LB 100 мкг / мл Amp и 12,5 мкг / мл Ти др. дополнен с глицерином (10% конечной концентрации). Когда оригинальный 384-луночных не клоны во всех скважинах, как и в случае с наиболее часто используемыми "Ahringer" библиотеки, есть несколько вариантов для организации дочь пластин. Клоны могут быть перераспределены таким образом, что нет никаких пустых скважин в дочерних пластинок. Это сводит к минимуму количество пластин на экран. В идеале, однако, во время репликации, несколько скважин на каждую дочь пластина должна быть пустой, так что они могут в дальнейшем быть заполнена стандартными клонов управления (положительные и отрицательные), которые облегчают через пластину сравнения. Эти 96-луночных дочь затем используются для заполнения 96-Deepwell пластин LB за ночь (ON) культуры. Все жидкие шагов обработки лучше всего делать с роботом системы обработки жидкости (например, Tecan), но может быть выполнена вручную, используя, например, 96-контактный репликатор. Если RNAi библиотеки клонов уже в 96-луночного формата перейдите к шагу 3.5. <oл началом = "2"> Инкубируйте 96-луночных RNAi дочь при 37 ° С при перемешивании (200 оборотов в минуту) по 14-15 часов. Убедитесь, что бактерии росли правильно и определить клоны, которые не растут. Они будут исключены из последующих анализов. В идеале, OD 600 измеряется в каждой лунке, но это может быть сделано путем простого осмотра. Хранить 96-луночных RNAi дочь при -80 ° C до использования. Таяние 96-луночных содержащие РНК-интерференции клонов при комнатной температуре. Пластины могут быть оставлены на 4 ° C до использования. Распространение 3 мкл каждого бактериальных клонов из 96-и повторить пластины 96 скважин соответственно помечены / штрих-96-Deepwell LB пластины, содержащей 1,5 мл LB 100 мкг / мл Amp и 12,5 мкг / мл Tet. Бактериальные клоны контролировать эффективность РНК-интерференции, такие, как GFP (RNAi) клона в данном примере, и отрицательный контроль, может быть включен вручную в любой доступной пустой хорошо. Обложка 96-р Deepwellкоррелирует с клейкой пленки (например, сотовые AeraSeal фильм культуре Dutscher). Замените использовать 96-и повторных пластины при температуре -80 ° C. 96-Deepwell помечены пластины инкубировали О при 37 ° С при перемешивании (200 оборотов в минуту по 14-15 часов). День 2 4. Семенной RNAi бактериальных клонов на 96-луночного NGM пластин RNAi Этот шаг следует делать утром следующего по культуре. Возьмите 96-луночного NGM плит от 4 ° C, и пусть они согреться и высохнуть в течение 5-15 мин в стерильной шкаф ламинарный поток. Не оставляйте пластины слишком долго под капотом (максимум 30 мин), а в противном случае NGM впоследствии может взломать. Добавьте соответствующие этикетки / штрих-кодов для каждой пластины. Получить 96-Deepwell О культуре пластин от 37 ° C. Запись позиции пустых скважин (пустой и совершенно прозрачный), они будут исключены из последующего анализа. Центрифуга 96-Deepwell пластин 5 мин при 4000 оборотах в минуту. Совет от супернатант поворота пластины резко вверх дном и просушить края пластины быстро на бумажное полотенце. Как культур рекомбинантных бактерий, супернатант необходимо обращаться в соответствии с местным законодательством (например автоклавного). Ресуспендируют бактериальных гранул в остаточной жидкости (примерно 50 мкл) на вортексе, в идеале с помощью специального агитатора (например, Tecan), так что каждая пластина получает точно такое же лечение. Это позволило измерить OD 600 в каждую лунку по стандартизации именно бактериальные инокулята для следующего шага, но это не является необходимым, и мы не выполнять такую ​​проверку. Передача 5 мкл ресуспендированного бактерий на 96-луночного NGM пластины, используя 8 или 12-канальный Multi-пипетки. Будьте осторожны, не трогайте и не проникают в НГО. Этот шаг осуществляется вручную, но могут быть оптимизированы с помощью роботов, таких как Liquidator96 (Rainin), что позволяетРаспределение 96 RNAi клонов в один шаг. Пусть бактерии под сухой стерильный кабинет ламинарного потока, проверки регулярно, чтобы избежать NGM становится слишком сухим. Этот шаг занимает около 2 часов. Инкубируйте 96-луночного RNAi-NGM пластин при 37 ° С во влажной камере. 5. Подготовить синхронизированы населения червей На этом этапе мы использовали трансгенных червей несущие ген-репортер (ы) интереса (например, инфекции индуцибельной с НЛП-29 :: GFP конструкции и, как внутренний контроль, учредительный р коллег-12 :: DsRed трансгенов построить) . В связи с наблюдаемым снижением экспрессии трансгена со временем, мы таять свежие партии червей каждые 6 недель. Мы культуру червей, по крайней мере 2 поколения перед использованием, и убедиться, что черви никогда не голодали перед анализом. Если день 2 протокола во вторник, мы готовим червей в пятницу размещение 30 молодых взрослых червей на 9 см NGM пластины распространяются с OP50 бактериипри 20 ° С, они будут готовы для отбеливания во вторник (см. Таблицу 1). Bleach червей в соответствии со стандартным протоколом 10. Пусть яиц вылупляются в M9 при 25 ° С при перемешивании, чтобы получить синхронизированы населения L1 личинок. День 3 6. Распространение червей на 96-и РНК-интерференции-NGM пластины для кормления и РНК-интерференции Этот шаг необходимо сделать в первой половине дня. L1 стадии синхронизированы червей распространяется на каждый 96-и бактериальных клонов для кормления и РНК-интерференции. Получить 96-и РНК-интерференции-NGM пластин от 37 ° C и оставить их при комнатной температуре, чтобы остыть. Получить беленой червей от 25 ° C. Оцените количество червей в 2 мкл и корректировать с M9 иметь около 100-120 червей на 2 мкл (примерно одна капля). Распространение вручную 2 мкл L1 стадии червей в каждую лунку помощью повторяющихся распылителя. Проверьте каждую лунку для червей (вы должны увидеть черви плавают в жидкости). Пусть пластины в сухом стерильном кабинете ламинарного потока (не более 1 часа). Проверьте пластины регулярно, черви должны ползать, а не плавать. Будьте осторожны, NGM не должна высыхать слишком много, иначе он треснет. Поместите пластин при 25 ° С во влажной камере. 7. Проверьте Drechmeria coniospora спор для эффективного заражения Этот шаг является специфическим для данного экрана. Она заключается в тестировании различных партий споры, чтобы выбрать из них высоко инфекционной. Поэтому это должно быть сделано как можно ближе до 4-й день, в день инфекции. Это необходимо подготовить достаточное L3-L4 червей заранее для этих тестов (табл. 1). Подробные описания методов, необходимых для D. coniospora культуры были описаны в других 11. <ол> Сбор спор по выборке каждый грибковые культуры в небольшом объеме M9. Поместите каплю каждой суспензии спор на 35 мм NGM пластина с присадками OP50, и дайте ему высохнуть. Добавить 30-40 L3-L4 червей проведение репортер гена (например, с НЛП-29 :: GFP). Поместите инфицированных пластин при 25 ° C ON. На следующий день проверить червей для GFP индукции и выбрать партию грибов, что дает яркий, широкий и наиболее однородной индукции зеленая флуоресценция. День 4 8. Инфекция RNAi подвергшихся воздействию червей D. coniospora споры Этот шаг выполняется через 30 часов после кормления, когда RNAi черви достигли L3-L4 стадии. Определить объем спор, используемый для распространения 4 мкл на лунку. Собирайте свежие D. coniospora спор с выбранной партии с буфером M9. Используйте 8-10 мл M9 для одного 9 см пластины спор. <LI> Распространение 4 мкл спор в каждую лунку с повторяющимися распылителя. Проверьте каждую лунку за спорами (вы можете увидеть червей купание в жидкости). Пусть пластины в сухом стерильном кабинете ламинарного потока (~ 1 час). Проверьте пластины регулярно, пока черви начинают ползать. Будьте осторожны, NGM не должна высыхать слишком много, иначе он треснет. Поместите инфицированных пластин при 25 ° С во влажной камере. День 5 9. Наблюдение и хранении плит до автоматизированного количественного анализа На этом этапе начинается через 18 часов после заражения и осуществляется в течение 5-й день. Черви, как ожидается, молодые люди начинают откладывать яйца. На этом этапе фенотип забил визуально: либо червей светиться зеленым, что соответствует нормальной ситуации после заражения или индукции GFP изменен в данной и это значит, что замолчать ген изменений в ответ на инфекцию. <LI> Быстро наблюдать пластин под флуоресценции рассечения микроскопом. Если пластины показать хорошее общее индукция GFP затем переходите к следующему шагу, в противном случае ждать, пока во второй половине дня для лучшего индукции, пока еще есть пища осталось червей. Визуально выиграть каждую тарелку и обратить внимание на хорошо заметный фенотип (например, не выражение GFP). К проверке полученных результатов с любой контроль клонов РНК-интерференции, которые могут быть добавлены, это первый предварительный анализ дает указание о том, эксперимент прошел успешно. Используя 8 или 12-канальный мульти Внесите передачи червей с 100 мкл 50 мМ NaCl-Тритон 0,05%, на новый, соответственно помечены / штрих-96-и круглым дном тарелку. Замораживание пластины при температуре -80 ° С до анализа. В день анализа, растопить пластины при комнатной температуре и перейти к автоматизированному анализу использования Copas Biosort. Сортировщик анализирует одну пластину на 22 минут. Плиты не должны бытьоставляют при комнатной температуре в течение более чем за час до анализа, и они не могут быть заморожены снова. Информации, полученной от Copas Biosort транскрибируются в файл Excel для беглого проверки качества данных. Исходные данные с различными параметрами измеряется Copas Biosort (оптической плотности (исчезновения), осевая длина (время полета), флуоресценция выбросов, одновременно три различных детекторов), затем хранятся в специальном пакете LIMS (MBio LIMS, Modul- Био) для последующего детального количественного анализа. 10. Представитель Результаты Использование количестве червей и бактерий, приведенные выше, в конце эксперимента, в большинстве скважин, животные должны все они разработаны для взрослых и не должно быть по-прежнему еду оставили во всех скважинах. В этих условиях большинство скважин должны также содержать яйца. Там должно быть достаточное количество взрослых в каждой лунке, так что Biosort данные получены еили, по крайней мере, 50 человек червей. С другой стороны, если RNAi эффективно, большое количество клонов RNAi вызовет видимого фенотипа. Например, черви могут быть несогласованными, и более очевидно, стерильный, или арестованы в их развитии. Это должно происходить часто, так что в целом по крайней мере одну скважину на 96-луночного планшета содержит червей очевидна фенотип RNAi. Когда фенотип интерес представляет экспрессию гена репортера GFP, скважин с GFP (RNAi) клон обеспечить надежный контроль (рис. 2). Другие фенотипы, такие как изменение размера можно легко измерить с Biosort (рис. 3А). Мы обнаружили, что черви могут мигрировать в соседние скважины при очень низких частот (<1%, BS, неопубликованные результаты), когда еду в хорошо ли закончатся. Сбивание функции различных классов генов могут влиять на трансгены выражение в C. Элеганс. Некоторые из них, не специально, необходимые для экспрессии гена 12. Другие, такиекак ткани специфические факторы транскрипции, например, эпидермальный фактор GATA ELT-3, 13, необходимо будет, в частности, множества клеток. Это одна из причин включения не связанных и учредительные эпидермальные клетки трансгенных репортер конструкции (р коллег-12 :: DsRed) в штамм, используемый для текущего протокола. Это позволяет таких генов следует отличать от тех, в особенности связанных с генной изучаемого процесса (рис. 3В и С). Это трансгенов выражается во все личиночной стадии. Если тест включает в себя обнаружение экспрессии генов в эмбрионах различных гена-репортера контроля не потребуется. Одним из новшеств этого протокола является использование замораживания плиты отложить их анализ. Замораживание позволяет плиты будут храниться в течение двух недель без существенного изменения результатов. Хотя абсолютные значения измеряемой флуоресценции могут быть изменены, их относительное соотношение останется примерно такой же (рис. 4). В Ветхом Заветеруку, RNAi является внутренне переменная экспериментальных 14 процедур. Чтобы получить надежные результаты и устранить многие потенциальные ложных срабатываний, RNAi экраны должны быть скопированы, по крайней мере один раз. Если эксперименты успешно проводятся, должно быть разумное соотношение между результатами, с одной пластины протестирована на разные дни. В частности, гены, которые оказывают сильное воздействие должно быть четко идентифицированы, даже если их точный количественный эффект не идентичны между дубликат пластин (рис. 5). Рисунок 1. Общая схема типичного эксперимента. Рисунок 2. Управление RNAi использованием клона ориентации GFP выражения. Трансгенные червей expressiнг конститутивно AP коллег-12 :: DsRed репортер и индуцибельной р НЛП 29 :: GFP репортер на твердой среде в 96-луночного планшета визуализировать помощью GFP рассечения микроскоп с фильтром позволяет одновременное наблюдение красного и зеленого свечения. Черви подвергались контролю (верхняя панель) или GFP RNAi клон (нижняя панель) в течение 48 часов. Панели по левую не инфицированы червями, правые черви 18 часов после заражения D. coniospora. Шкалы 1 мм. Рисунок 3. Количественный анализ 96-луночного планшета. Copas Biosort формирует цифровые данные для каждого червя проанализированы. Из графиков видно, среднего и стандартного отклонения для времени пролета (TOF;), которая соответствует размеру червей 15, красной флуоресценции (б) и отношения (X100) из зеленого свечения для TOF (C) трансгенных горесреднеквадратичное выразил конститутивно AP коллег-12 :: DsRed репортер и индуцибельной р НЛП 29 :: GFP репортер, который культивировали в твердой среде в 96-луночного планшета с различными RNAi клонов в течение 48 часов, 18 часов после заражения D. coniospora. Некоторые клоны, такие как, подсвеченный со стрелкой в (A), провоцируют рост дефектов и / или влиять на экспрессию р коллег-12 :: DsRed. Другие, в частности, влияют на GFP выражение, как было подчеркнуто на стрелку в (С). Данный клон цели гена nsy 1, ранее показано, что важно для регулирования НЛП 29 13. Зеленый, красный флуоресценции и TOF измеряется в произвольной, но постоянные единицы. Рисунок 4. CompАрисон данных, полученных с живой и замороженных образцов того же эксперимента. Плиты L4 червей проведение с НЛП-29 :: GFP и с кол-12 :: DsRed трансгены были либо заражены D. coniospora или нет. После 18 часов, каждая пластинка была условно разделить на 2, половина была проанализирована сразу, а половина замораживали при -80 ° C в течение 24 часов, до оттаивания и анализа. Значения среднего пролета (размер червей), EXT (оптической плотности) и зеленый и красный флуоресценции рассчитаны для каждого образца. На графике показано соотношение в среднем за инфицированными разделены неинфицированных образцов, для замороженных и живых образцов (п = 7638 и 5096, и 8634 и 3850 черви, соответственно). Рисунок 5. Сравнительный анализ повторяющихся 96-луночных планшетах. Нормализованное отношение флуоресценции (среднее отношение флуоресценции (в данном случае, 100 * зеленый / TOF) для каждой скважины разделенаобрезанного (25-го по 75-й процентиль) означает для каждой пластины) для каждой скважины из дубликатов анализ представитель 96-луночного планшета. Материал Экспериментальные Timeline IPTG: ~ 1,4 мл Ампициллин: ~ 5 мл Тетрациклин: ~ 5 мл Л.Б.: 5 л 96-и плоских пластин: 30 для НГО 96-и круглых пластин: 30 для замораживания (анализ) 96-Deepwell плиты: 30, о культуре культура фильма: 30 Советы коробке: 30 для посева бактерий 9 см OP50 плиты: ~ 17 Черви: 1 свежий талой cyrovial в месяц Споры: ~ 2 пластины 50 мМ NaCl + 0,05% Тритон: ~ 300 мл Четверг Подготовка NGM RNAi 96-луночных планшетах (~ 1 час + автоклав) Пятница Подготовка 96-Deepwell LB пластин (~ 4 часа) Подготовка червей (14 пластин с 30 молодых взрослых червей при 20 ° С + 1 пластина при температуре 25 ° C) Понедельник Передача червей пластины на 25 ° C на новой пластинке Распространение бактерий в LB пластин (~ 7 часов) О культуре в 6 часов вечера Вторник Распространение бактерий на NGM пластин в первой половине дня (~ 3 часа+ ~ 2 часа сушки) Bleach червей из пластин при 20 ° C Среда Распространение червей в 10 часов утра (~ 1 час + 1 час ~ сушки) Испытание спор с червями из пластины при температуре 25 ° C Четверг Инфекция червей в 3 часа дня (~ 1 час + 1 час ~ сушки) Пятница Трансфер в новом 96-луночных + замораживание (~ 2 часа) Таблица 1. Пример одного цикла эксперимента с 30 пластинами. Здесь представлены материалы, необходимые для одного цикла эксперимента на 30 пластин и сроки эксперимента с шага 1 к шагу 12 организовано на 9 дней. Нематоды рост средств массовой информации (НГО), 100 мл: 0.3 г NaCl 0,25 г BactoPeptone 2 г BactoAgar 100 мкл 5 мг / мл холестерина в этаноле Добавить деионизированной водой до 100 мл Автоклав в течение 5 минут при 121 ° C и дайте остыть, затем добавить: 100 мкл 1 М MgSO 4 100 мкл 1 М CaCl 2 2,5 мл 1 M КПО 4 6,0 рН NGM для RNAi лечение в 96-луночного планшета, 100 мл: 0,29 г NaCl 0,25 г BactoPeptone 1,7 г BactoAgar 100 мкл 5 мг / мл холестерина в этаноле Добавить де ионизированной водой до 100 мл Автоклав в течение 5 минут при 121 ° C и дайте остыть, затем добавить: 100 мкл 1 М MgSO 4 100 мкл 1 М CaCl 2 2,5 мл 1 M КПО 4 6,0 рН 400 мкл 1 M IPTG 100 мкл 100 мг / мл ампициллина 100 мкл 12,5 мг / мл тетрациклина Bleach решение, 5 мл: 2,5 мл H 2 O 2,3 мл Bleach 0,2 мл 50% NaOH NaOH 50%, 100 мл: 50 г NaOH Добавить деионизированной водой до 100 мл 50 мМ NaCl-Тритон 0,05%, 400 мл: 4 мл 5 М NaCl 1 мл Triton 20% Добавить деионизированной водой до 400 мл ТЭП "> Triton 20%, 10 мл: 2 мл Тритон Х-100 8 мл дистиллированной воды M9 буфера, 1л 6 г Na 2 HPO 4 (MW: 178) 3 г KH 2 PO 4 (MW: 136) 5 г NaCl Добавить деионизированной водой до 1 л Автоклав Добавить 1 мл MgSO 4 1 M Лурия бульон (LB), 1л: 10 г BactoTryptone 20 г Дрожжевой экстракт 10 г NaCl Добавить деионизированной водой до 1 л Автоклав 1 М MgSO 4, 300 мл: 73,95 г MgSO 4 Добавить деионизированной водой до 300 мл Автоклав и хранить при комнатной температуре 5 мг / мл, холестерина, 200 мл: 1 г Холестерин Добавить 100% этанолом до 200 мл Фильтр стерилизовать и хранить при комнатной температуре 1 М CaCl 2, 500 мл: 27.75 г CaCl 2 Добавить деионизированной водой до 500 мл Фильтр стерилизовать и хранить при комнатной температуре 1 M КПО 4 рН 6,0, 4 L: 517 г KH 2 PO 4 (MW: 136) 207 г K 2 HPO 4 (MW: 174) Добавить деионизированной воды до 4 л 100 мг / мл ампициллина (Amp), 10 мл: 1 г ампициллина Добавить деионизированной водой до 10 мл Хранить при температуре от -20 ° C 1 M изопропиловый β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 мл: 2,38 г IPTG Добавить деионизированной водой до 10 мл Хранить при температуре от -20 ° C 12,5 мг / мл тетрациклина, 100 мл 1,25 г тетрациклина Добавить 100% этанолом до 100 мл Таблица 2. Решения.