Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans</em

O protocolo como descrito abaixo é dividida em etapas em cinco dias sucessivos (Fig. 1). Como se observa, certos passos pode ser feito em dias diferentes. A duração de cada passo, bem como a quantidade de material requerida (vermes por exemplo, bactérias, meios de comunicação) irá depender do número de placas de 96 poços tratados por experiência. Dia 1 1. Preparação das placas de 96 poços NGM RNAi O protocolo seguinte é adaptado a partir do método padrão para a tomada de placas de cultura de vermes 10, que inclui os pormenores das técnicas de esterilização para as diferentes soluções. Para 10-12 placas de 96 poços, a preparação de 100 mL de meio de crescimento nematóide (NGM) em desionizada H2O: 1,7 g BactoAgar, 0,29 g de NaCl, 0,25 g de peptona, 100 uL de colesterol (5 mg / mL em EtOH). Autoclave NGM (5 min a 121 ° C durante 100 mL; 30 min a 121 ° C durante 4 L) e deixar arrefecer até que seja menos cerca de 50 ° C (eno apenas frescough para segurar). É importante que o NGM permanece quente suficiente para que ele não se solidifica. Adicionar a 100 mL: 2,5 mL de tampão fosfato pH 6 (1M), 100 uL MgSO 4 (1M), 100 uL de CaCl2 (1M), 400 uL IPTG (1M), 100 uL Ampicilina (100 mg / mL), 100 uL de tetraciclina (12,5 mg / mL em EtOH). Distribuir 75 uL de NGM a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano. Para evitar a solidificação do meio, que necessita de ser dispensado rapidamente, é conveniente usar um dispensador repetitivo (por exemplo, Repeatman, Eppendorf). Certifique-se que não há bolhas de ar presentes nos poços. Armazenar as placas imediatamente numa câmara húmida (por exemplo, uma caixa de Tupperware com toalhas de papel molhado na parte inferior), a 4 ° C. Nota: as placas podem ser preparados até uma semana antes e armazenadas a 4 ° C, o que pode tornar a organização de etapas subsequentes mais fácil. 2. Preparação automatizada de as placas de 96-DeepWell LB <li> Preparar e distribuir 1,5 mL LB contendo ampicilina e tetraciclina 100μg/mL 12,5 mcg / ml a cada poço de uma placa de 96 DeepWell que tem uma capacidade máxima de 2 mL / poço. A distribuição é optimizada utilizando um sistema de manipulação de robótico líquido (por exemplo TECAN), mas também pode ser realizada manualmente, se necessário. Adicionar uma tampa para cada placa e armazenar a 4 ° C. A fim de controlar cada placa de 96 poços, um rótulo de código de barras único ou deve ser adicionado, nesta fase ou posteriormente. Nota: as placas podem ser preparados de 2 a 3 dias de antecedência e armazenado a 4 ° C, o que pode tornar a organização de etapas subsequentes mais fácil. 3. Crescer os clones RNAi bacterianas nas placas de 96-DeepWell LB (cultura durante a noite) Para facilidade de manuseamento subsequente, quando os clones originais de RNAi da biblioteca estão num formato de 384 poços, redistribuir os clones em primeiro rotulados ou de código de barras padrão de 96 poços contendo placas LB com 100 Amp ug / mL e 12,5 mcg / mL Tet suplementado com glicerol (10% de concentração final). Quando as placas originais 384-assim não têm clones em todos os poços, como é o caso para o "Ahringer" mais comumente utilizado biblioteca, existem várias opções para organizar as placas filhas. Os clones podem ser re-distribuído de modo que não existem poços vazios nas placas filhas. Isto minimiza o número de placas a tela. Idealmente, contudo, durante a replicação, alguns poços em cada placa filha deve ser deixado vazio, de modo que estes podem ser posteriormente preenchido com clones de controlo padrão (positivo e negativo) que facilitam ao longo da placa-comparações. Estas placas de 96 poços filhas são então utilizados para sementes das placas 96-DeepWell LB para uma cultura (ON) durante a noite. Todos os passos de manipulação de líquidos são melhor feito com um sistema de manipulação de robótico líquido (por exemplo Tecan), mas pode ser realizada manualmente utilizando, por exemplo, um replicador de 96 pinos. Se os clones RNAi biblioteca já estão em um formato de 96 poços vá para o passo 3.5. <ol start = "2"> Incubar as placas de 96 poços filha RNAi a 37 ° C com agitação (200 rpm) durante 14-15 horas. Verificar que as bactérias cresceram correctamente e identificar clones que não crescem. Estes serão excluídos das análises posteriores. Idealmente, o OD 600 é medida em cada poço, mas isto pode ser feito por inspecção simples. Armazenar as placas de 96 poços filha RNAi a -80 ° C antes da utilização. Descongelar as placas de 96 poços contendo os clones RNAi à temperatura ambiente. As placas podem então ser mantida a 4 ° C até à utilização. Distribuir 3 uL de cada clone bacteriano a partir de uma placa de 96 poços replicar para os 96 poços da placa de LB correspondentemente rotulados / código de barras 96-DeepWell contendo 1,5 mL de LB com 100 Amp ug / mL e 12,5 mcg / mL Tet. Clones bacterianos para controlar RNAi eficiência, tal como um clone GFP (RNAi) no presente exemplo, e controlos negativos, pode ser incorporado em qualquer manualmente bem disponível vazio. Cobrir a 96-p DeepWelllates com uma película adesiva (película cultura por exemplo AeraSeal celular a partir de Dutscher). Substituir a placa de 96 poços utilizado replicar a -80 ° C. As placas 96-DeepWell marcados são, em seguida, incubou-se em a 37 ° C com agitação (200 rpm durante 14-15 horas). Dia 2 4. Semente os clones RNAi bacterianas sobre as placas de 96 poços NGM RNAi Esta etapa deve ser feito na manhã seguinte à cultura ON. Tomar as placas de 96 poços NGM a partir de 4 ° C e deixá-los aquecer e secar para 5-15 min sob um fluxo laminar estéril armário. Não deixe as placas muito tempo sob o capô (máximo de 30 min), caso contrário o NGM pode posteriormente crack. Adicione o rótulo adequado / código de barras para cada prato. Recuperar o 96-DeepWell em placas de cultura de 37 ° C. Gravar as posições de quaisquer poços vazios (um poço vazio é completamente translúcida), os quais serão excluídos das análises subseqüentes. Centrifugar a 96-DeepWell placas 5 min a 4000 rpm. Ponta fora o sobrenadante, girando a placa de cabeça para baixo acentuadamente e secar as bordas da placa rapidamente sobre uma toalha de papel. À medida que as culturas são de bactérias recombinantes, o sobrenadante tem de ser tratada de acordo com a legislação local (por exemplo, autoclavado). Ressuspender o sedimento bacteriano no líquido residual (cerca de 50 uL) em vórtice, de preferência usando um agitador dedicado (por exemplo, Tecan) de modo que cada placa recebe precisamente o mesmo tratamento. É possível medir a OD 600 de cada poço para padronizar precisamente inoculo bacteriano para o passo subsequente, mas isto não é indispensável, e não realizar tal controlo. Transferir 5 uL das bactérias ressuspensos para as placas de 96 poços utilizando um NGM 8 ou 12-multi-canal da pipeta. Tenha cuidado para não tocar ou penetrar na NGM. Este passo é executado manualmente, mas pode ser optimizada utilizando um robot, tais como o Liquidator96 (Rainin) que permite que odistribuição de 96 clones RNAi em um passo. Deixe as bactérias seco ao abrigo de um gabinete de fluxo laminar estéril, verificando regularmente para evitar o NGM tornar-se demasiado seco. Esta etapa deve levar cerca de 2 horas. Incubar as 96-poços RNAi-Ngm as placas a 37 ° C em numa câmara húmida. 5. Prepare uma população sincronizada de worms Para esta etapa, usamos worms transgênicas com o gene repórter (s) de interesse (por exemplo, uma infecção induzida p-nlp-29 :: GFP construção e, como um controle interno, uma p constitutiva col-12 :: transgene dsRed construção) . Por causa da diminuição observada de expressão do transgene com o tempo, nós descongelar lotes frescas de vermes cada 6 semanas. Nós, os worms de cultura para pelo menos 2 gerações antes da utilização, e garantir que os vermes nunca passaram fome antes do ensaio. Se o dia 2 do protocolo é terça-feira, nos preparamos worms na sexta-feira, colocando 30 vermes adultos jovens em uma placa NGM 9 centímetros espalhar com OP50 bactériasa 20 ° C; eles estará pronto para lixívia na terça-feira (ver Tabela 1). Worms Bleach seguindo o protocolo padrão de 10. Deixe os ovos eclodem em M9 a 25 ° C ON com agitação para obter uma população sincronizado de larvas L1. Dia 3 6. Distribua os vermes nos 96-RNAi bem-Ngm placas de alimentação e RNAi Este passo deve ser feito de manhã. Worms L1 estágio sincronizados são distribuídos em cada clone 96-bacteriana bem para alimentação e RNAi. Recuperar os 96-poços RNAi-Ngm placas de 37 ° C e deixá-los à temperatura ambiente para arrefecer. Recuperar os vermes esbranquiçados de 25 ° C. Estimar o número de vermes por 2 uL e ajuste com M9 ter cerca de 100-120 vermes por 2 microlitro (aproximadamente uma gota). Distribuir manualmente 2 l da L1 estágios worms em cada cavidade utilizando um dispensador repetitivo. Verifique cada bem para os vermes (worms você deve ver nadando em líquido). Deixe as placas seco sob um armário estéril de fluxo laminar (hora máximo 1). Verifique regularmente as placas, os vermes deve ser engatinhando e não nadar. Tenha cuidado, a NGM não deve secar muito, senão ele vai quebrar. Colocar as placas a 25 ° C em câmara húmida. 7. Teste os esporos Drechmeria coniospora para infecção eficaz Este passo é específico para o ecrã presente. Ele consiste em testar diferentes lotes de esporos para selecionar aqueles altamente infecciosa. Por conseguinte, deve ser feito tão próximo quanto possível antes do dia 4, o dia da infecção. É necessário preparar suficientes L3-L4 vermes em avanço para estes testes (Tabela 1). Os métodos de execução necessários para a D. cultura coniospora têm sido descritas noutro local 11. <ol> Collect esporos de uma amostra de cada cultura de fungos em um pequeno volume de M9. Coloque uma gota de cada suspensão de esporos em uma placa NGM 35 milímetros semeado com OP50, e deixe secar. Adicionar 30-40 L3-L4 vermes com o gene repórter de interesse (por exemplo, p nlp-29 :: GFP). Colocar as placas infectadas a 25 ° C ON. No dia seguinte, confira os vermes para a indução do GFP e selecione o lote de fungo que dá brilho a indução, a mais ampla e mais homogêneo de fluorescência verde. Dia 4 8. Infectar o RNAi exposto worms com D. esporos coniospora Este passo é realizado 30 horas após a alimentação quando RNAi vermes atingiram a fase L3-L4. Determinar o volume de esporos para usar para distribuir 4 uL por poço. Colete D. fresco esporos coniospora a partir do lote seleccionado com tampão M9. Use 8-10 mL de M9 para uma placa de 9 cm de esporos. <li> Distribuir 4 uL de esporos em cada poço com um dispensador repetitivo. Verifique cada poço de esporos (você pode ver a natação worms em líquido). Deixe as placas seco sob um armário estéril de fluxo laminar (~ 1 hora). Verifique as placas regularmente até os vermes iniciar o rastreamento. Tenha cuidado, a NGM não deve secar muito, senão ele vai quebrar. Colocar as placas infectadas a 25 ° C em câmara húmida. Dia 5 9. Observação e armazenamento das placas, antes da análise quantitativa automatizado Este passo é iniciado 18 horas após a infecção e é realizada durante 5 dias. Worms são esperados para ser jovens adultos começam a pôr ovos. Durante este passo, o fenótipo é pontuada visualmente: ou vermes fluorescência verde que corresponde a uma infecção situação normal sequência, ou a indução da GFP é alterada de uma dada bem que significa que as alterações genéticas silenciados a resposta à infecção. <li> rapidamente observar as placas sob o microscópio de fluorescência de dissecação. Se as placas mostram uma indução GFP bem geral então prosseguir para o passo seguinte, caso contrário, esperar até à tarde para uma melhor indução, enquanto ainda há comida deixada para os vermes. Visualmente marcar cada placa e observe qualquer bem com um fenótipo marcado (por exemplo, nenhuma expressão de GFP). Ao verificar pelos resultados obtidos com quaisquer clones de controlo RNAi que possam ter sido adicionados, esta análise preliminar primeiro dá uma indicação de se a experiência tem sido bem sucedida. Usando um 8 ou 12 multi-canal de transferência Pipetar os vermes com 100 ul de NaCl 50 mM-Triton 0,05%, para uma nova correspondentemente rotulados / código de barras de 96 poços de fundo redondo de chapa. Congelar as placas à temperatura de -80 ° C até à análise. No dia da análise, descongelar as placas à temperatura ambiente e proceder à análise automatizada usando o Biosort COPAS. O classificador analisa um único prato em 22 minutos. As placas não deve serdeixada à temperatura ambiente por mais de uma hora antes da análise, e não podem ser congelados novamente. As informações obtidas a partir da Biosort COPAS são transcritos para um arquivo do Excel para verificação rápida da qualidade dos dados. Os dados em bruto com os diferentes parâmetros medidos pelo Biosort COPAS (densidade óptica (extinção), o comprimento axial (tempo de voo), as emissões de fluorescência, simultaneamente por três detectores diferentes) são então armazenados em um pacote LIMS dedicado (MBiO LIMS, Modul- Bio) para posteriores análises quantitativas detalhadas. 10. Os resultados representativos Usando as quantidades de vermes e bactérias dadas acima, no final da experiência, na maioria dos poços, os animais devem todos têm desenvolvido até à idade adulta e deve ainda haver algum alimento deixado em todas as cavidades. Sob estas condições, a maioria dos poços devem também conter ovos. Deve haver um número suficiente de adultos em cada poço de modo que os dados são obtidos Biosort fou pelo menos 50 vermes individuais. Por outro lado, se o RNAi é eficiente, um grande número de clones RNAi irá provocar um fenótipo visível. Por exemplo, os worms podem ser descoordenada, ou mais, obviamente, estéril, ou preso em seu desenvolvimento. Isto deve ocorrer com frequência, de modo que, geralmente, pelo menos, um poço por placa de 96 poços contém vermes com um fenótipo RNAi evidente. Quando o fenótipo de interesse é a expressão de um gene repórter da GFP, poços com um clone de GFP (RNAi) proporcionar um controlo robusto (Fig. 2). Outros fenótipos, tais como uma alteração de tamanho podem ser prontamente medido com o Biosort (Fig. 3A). Observamos que os vermes podem migrar para poços adjacentes em freqüência muito baixa (<1%, BS, resultados não publicados), quando o alimento em um poço que acabar. Derrubar a função de diferentes classes de genes podem afetar a expressão de transgenes C. elegans. Alguns são não-especificamente necessária para expressão transgenes 12. Outros, taiscomo factores de transcrição específicos de tecidos, por exemplo, o factor GATA epidérmica ELT-3 13, será necessária em subconjuntos específicos de células. Esta é uma das razões para a inclusão de um não-relacionadas e constitutiva epidérmica célula repórter transgene construto (p col-12 :: dsRed) na estirpe utilizada para o protocolo de corrente. Isto permite que tais genes a serem distinguidos dos especificamente envolvidas no processo de gene regulador em estudo (Fig. 3B e C). Este transgene é expresso durante todas as fases larvares. Se um ensaio envolve a detecção de expressão do gene em embriões de um gene repórter diferente de controlo seria necessária. Uma das inovações deste protocolo é o uso de placas de congelamento para adiar a sua análise. Congelação permite placas a ser armazenado por até duas semanas sem alterar substancialmente os resultados. Embora os valores absolutos de fluorescência medida poderá ser alterado, suas proporções relativas permanecem semelhante (Fig. 4). No otsua mão, RNAi é um procedimento de 14 intrinsecamente variável experimental. Para obter resultados robustos e eliminar os potenciais muitos falsos positivos, telas de RNAi precisam ser replicados, pelo menos uma vez. Se as experiências são realizadas com êxito, deve haver uma correlação razoável entre os resultados de uma placa de testado em dias diferentes. Particularmente, os genes que possuem um forte efeito deve ser claramente identificáveis, mesmo se o efeito preciso quantitativa não é idêntica entre as placas em duplicado (Fig. 5). Figura 1. Regime geral de uma experiência típica. Figura 2. Controlo RNAi utilizando um clone de segmentação expressão da GFP. Transgênicos worms expressividadeng constitutivamente ap col-12 :: repórter dsRed e uma induzível p nlp 29 :: GFP repórter em meio sólido em uma placa de 96 poços visualizada utilizando um microscópio de dissecção GFP com um conjunto de filtro que permite a observação simultânea de fluorescência vermelha e verde. Worms foram expostos a controlar (painéis superiores) ou um GFP RNAi clone (painéis inferiores) durante 48 h. Os painéis à esquerda são vermes não infectados, aqueles sobre os vermes direito 18 horas após a infecção com D. coniospora. A barra de escala é de 1 mm. Figura 3. A análise quantitativa de uma placa de 96 poços. O Biosort COPAS gera dados numéricos para cada verme analisados. Os gráficos mostram a média e desvio padrão para o tempo de voo (TOF; A), que corresponde ao tamanho dos vermes 15, fluorescência vermelha (B) e da razão (X100) de fluorescência verde para TOF (C) do transgénico WOrms expressando constitutivamente ap col-12 :: repórter dsRed e uma induzível p nlp 29 :: GFP repórter que tinha sido cultivado em meio sólido em uma placa de 96 poços com diferentes clones RNAi durante 48 h, 18 horas após a infecção com D. coniospora. Certos clones, tais como a um destaque com a seta em (A), os defeitos de crescimento e / ou provocam afectar a expressão de p col-12 :: dsRed. Outros, especificamente afetar a expressão da GFP, como destacado pela seta em (C). Este clone particular, tem como alvo o gene nsy 1, previamente demonstrado ser importante para a regulação da PNL 29 13. Verde, vermelho e fluorescência TOF são medidos em unidades arbitrárias, mas constante. Figura 4. CompArison dos dados obtidos com amostras vivas e congeladas a partir da mesma experiência. Placas de L4 vermes que transportam p nlp-29 :: GFP e col p-12 :: transgenes dsRed ou foram infectados com D. coniospora ou não. Depois de 18h, cada placa foi dividido em 2; meia foi analisado imediatamente e meia congeladas a -80 ° C durante 24 horas, antes de descongelação e análise. Os valores para média TOF (tamanho de vermes), EXT (densidade óptica) e Green e fluorescência vermelha foram calculados para cada amostra. O gráfico mostra a relação entre a média para infectados dividido por não-infectadas amostras, para as amostras congeladas e vivo (n = 7638 e 5096, e 8634 e 3850 vermes, respectivamente). Figura 5. A análise comparativa dos duplicados placas de 96 poços. A razão de fluorescência normalizada (a razão entre a fluorescência média (aqui, 100 * verde / TOF) para cada poço dividido porrecortada (25 ° ao 75 percentil) significa para cada placa) para cada poço de análises em duplicado de um representante placa de 96 poços. Material Cronograma Experimental IPTG: ~ 1,4 mL Ampicilina: ~ 5 mL Tetraciclina: ~ 5 mL LB: 5 L Placas de 96 poços planas: 30 para NGM Placas de 96 poços redondos: 30 para congelação (análise) 96-DeepWell pratos: 30 para a cultura película cultura: 30 Dicas caixa: 30 para a semeadura de bactérias 9 cm OP50 placas: 17 ~ Worms: 1 recém-descongeladas cyrovial por mês Esporos: ~ 2 placas NaCl 50 mM + 0,05% de Triton: ~ 300 mL Quinta-feira Preparar o RNAi NGM placas de 96 poços (~ 1h + autoclave) Sexta-feira Preparar as placas de 96-DeepWell LB (~ 4H) Preparar vermes (14 placas com 30 vermes adultos jovens a 20 ° C + 1 placa a 25 ° C) Segunda-feira Transferência worms de placa a 25 ° C na placa de novo Distribuir bactérias em placas de LB (~ 7H) Sobre a cultura em seis horas Terça-feira Distribuir bactérias em placas NGM da manhã (3h ~+ De ~ de 2h secagem) Worms Bleach de placas a 20 ° C Quarta-feira Distribuir worms menos 10 am (~ ~ de 1H + 1h de secagem) Esporos de teste com vermes em placas a 25 ° C Quinta-feira Infect worms em 3 pm (~ ~ de 1H + 1h de secagem) Sexta-feira Transferência de novo 96-lamelas + congelamento (~ 2h) Tabela 1. Exemplo de uma experiência um ciclo com 30 placas. Aqui é apresentado o material necessário para uma experiência de um ciclo de 30 placas e um cronograma para um experimento a partir do passo 1 a passo 12 organizados em 9 dias. Nematóides meios de crescimento (NGM), 100 ml: 0.3 g NaCl 0,25 g BactoPeptone 2 g BactoAgar 100 L 5 mg / mL de colesterol em EtOH Adicionar água desionizada para 100 ml Autoclave durante 5 minutos a 121 ° C e deixar arrefecer, em seguida, adicionar: 100 L 1 M MgSO4 100 L 1 M de CaCl2 2,5 mL 1 M pH 6,0 KPO4 NGM para RNAi tratamento em placa de 96 poços, 100 mL: 0,29 g NaCl 0,25 g BactoPeptone 1,7 g BactoAgar 100 L 5 mg / mL de colesterol em EtOH Adicionar de água para ionizado 100 mL Autoclave durante 5 minutos a 121 ° C e deixar arrefecer, em seguida, adicionar: 100 L 1 M MgSO4 100 L 1 M de CaCl2 2,5 mL 1 M pH 6,0 KPO4 400 uL 1 M IPTG 100 L 100 mg / ml de ampicilina 100 L 12,5 mg / ml de tetraciclina Solução de água sanitária, 5mL: 2,5 mL de H2O 2,3 mL Bleach 0,2 mL de NaOH 50% NaOH a 50%, 100 mL: 50 g de NaOH Adicionar água desionizada para 100 ml NaCl 50 mM-Triton 0,05%, 400 mL: 4 mL de NaCl 5 M 1 mL de Triton 20% Adicionar água desionizada para 400 ml tep "> Triton 20%, 10 mL: 2 mL de Triton X-100 8 mL de água deionizada Tampão M9, 1L 6 g de Na 2 HPO 4 (MW: 178) 3 g KH 2 PO 4 (MW: 136) 5 g de NaCl Adicionar água desionizada para 1 L Autoclave Adicionar 1 mL MgSO4 1 M Luria Broth (LB), 1L: 10 g BactoTryptone O extracto de levedura 20 g 10 g de NaCl Adicionar água desionizada para 1 L Autoclave 1 M MgSO4, 300 mL: 73,95 g MgSO 4 Adicionar água desionizada para 300 ml Autoclave e armazenamento em temperatura ambiente 5 mg / Colesterol mL, 200 mL: 1 g Colesterol Adicionar 100 EtOH% a 200 mL Filtrar esterilizar e armazenar em temperatura ambiente 1 M de CaCl2, 500 mL: 27.75 g de CaCl2 Adicionar água desionizada para 500 ml Filtrar esterilizar e armazenar em temperatura ambiente 1 M KPO 4 pH 6,0, 4 L: 517 g KH 2 PO 4 (MW: 136) 207 g de K 2 HPO 4 (MW: 174) Adicionar água desionizada para 4 L 100 mg / ml de ampicilina (Amp), 10 mL: 1 g de Ampicilina Adicionar água desionizada a 10 mL Armazenar a -20 ° C 1 M isopropílico β-d-tiogalactopiranósido (IPTG), 10 mL: 2,38 g IPTG Adicionar água desionizada a 10 mL Armazenar a -20 ° C 12,5 mg / ml de tetraciclina, 100 mL 1,25 g de tetraciclina Adicionar 100% EtOH a 100 mL Tabela 2. Solutions.