Отслеживание нейтрофилов внутрипросветный Crawling, трансэндотелиальной миграции и Хемотаксис в ткани Прижизненное микроскопии видео
Summary
Мы опишем протокол светлое прижизненной микроскопии для измерения динамических нейтрофилы, эндотелиальные клетки при взаимодействии нейтрофилов вербовки в ответ на источник нейтрофилов хемоаттрактант в естественных условиях. Нейтрофилов внутрипросветный ползать, трансэндотелиальной миграцию и хемотаксис в мышечной ткани мышей кремастер визуализируются с временем истек фотографии видео и отслеживается с ImageJ.
Abstract
Вербовки циркулирующих лейкоцитов из крови к воспаленной ткани является важным и сложным процессом воспаления 1,2. В посткапиллярных венул воспаленных тканей, лейкоцитов первоначально троса-н-ролл на просвета поверхности венул стене. Роллинг лейкоцитов ареста на эндотелий и пройти фирмы адгезии в ответ на хемокинов или других хемоаттрактантов на венул поверхности. Многие приверженцем лейкоцитов переселиться из начальном участке адгезией к соединительного сайт кровоизлияние в эндотелия, процесс, который называют внутрипросветный ползком 3. После сканирования, лейкоциты перемещаются по эндотелия (переселение) и мигрировать в ткани внесосудистое к источнику хемоаттрактант (хемотаксис) 4. Прижизненные микроскопия является мощным инструментом для визуализации лейкоцитов эндотелиальных взаимодействий клетка в естественных условиях и выявление клеточных и молекулярных механизмов лейкоцитов вербовки 2,5. В этом докладе, мы предоставляем полное описание использования светлого прижизненной микроскопии для визуализации и определяет конкретные процессы нейтрофилов набора мышечной мыши кремастер в ответ на градиент нейтрофилов хемоаттрактант. Для стимулирования нейтрофилов найма, небольшой кусок геля агарозы (~ 1 мм, 3 размера), содержащие нейтрофилов хемоаттрактант MIP-2 (CXCL2, хемокинов CXC) или WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, синтетический аналог бактериальных пептид) помещается на мышечной ткани, прилегающих к наблюдали посткапиллярных венулы. С течением времени, истек фотографии видео-и компьютерные программы ImageJ, нейтрофилов внутрипросветный ползет по эндотелия, нейтрофилов трансэндотелиальной миграция и миграция и хемотаксис в ткани визуализируются и отслеживаться. Этот протокол позволяет надежно и количественного анализа многих нейтрофилов параметры набора таких как внутрипросветный скорость сканирования, переселение время, отряд время миграция скорости, хемотаксис скорости и хемотаксис индекса в ткани. Мы показываем, что с помощью этого протокола, эти параметры набора нейтрофилов может быть стабильно и определяется одним передвижения ячейки удобно отслеживать в естественных условиях.
Protocol
Discussion
Прижизненные микроскопия является существенным инструментом для выявления клеточных и молекулярных механизмов лейкоцитов вербовки во время воспаления. Количественные визуализации для определения лейкоцитов эндотелиальных клеток взаимодействий в микроциркуляторном русле полупр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана исследовательский грант Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR, СС-86749). Л. Лиу является получателем CIHR Новая премия следователя (MSH-95374).
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
- Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
- Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
