Summary

تتبع الزحف داخل اللمعة العدلات ، والهجرة والانجذاب الكيميائي Transendothelial في الأنسجة بواسطة الميكروسكوب فيديو Intravital

Published: September 24, 2011
doi:

Summary

وصفنا على بروتوكول المجهري brightfield intravital لقياس ديناميكية التفاعلات الخلية العدلة البطاني خلال تجنيد العدلة ردا على مصدر جاذب كيميائي العدلة في الجسم الحي. العدلة الزحف داخل اللمعة ، والهجرة وtransendothelial الكيميائي في الأنسجة العضلية الماوس المشمرة وتصور مع التصوير الفيديو وانقضى الوقت مع ImageJ مجنزرة.

Abstract

توظيف تعميم الكريات البيض من مجرى الدم إلى الأنسجة الملتهبة هو عملية حاسمة ومعقدة من 1،2 الالتهابات. في الوريدات شعيرة وريدية من الأنسجة الملتهبة ، الكريات البيض في البداية حبل ولفة على سطح الجدار وريدي اللمعية. المتداول الكريات البيضاء القبض على التصاق البطانة والخضوع الشركة استجابة لchemokine chemoattractants أو أخرى على السطح وريدي. ووصف عملية نقل العديد من الكريات البيض ملتصق من موقع الأولي للانضمام الى موقع التسرب صلي في البطانة ، داخل اللمعة الزحف 3. التالية الزحف والتحرك عبر بطانة الكريات البيض (التهجير) وتهاجر في أنسجة خارج الأوعية نحو مصدر جاذب كيميائي (الكيميائي) 4. Intravital المجهر هو أداة قوية لتصور التفاعلات خلية الكريات البيض في الجسم الحي البطاني وكشف الآليات الخلوية والجزيئية للتجنيد 2،5 الكريات البيض. في هذا التقرير ، ونحن نقدم وصفا شاملا لاستخدام brightfield intravital المجهري لتصور وتحديد العمليات التفصيلية للتجنيد في العضلات العدلة المشمرة الماوس ردا على التدرج من جاذب كيميائي العدلة. للحث على تجنيد العدلة ، وقطعة صغيرة من هلام agarose (~ 1 ملم 3 الحجم) التي تحتوي على جاذب كيميائي العدلة MIP – 2 (CXCL2 ، وهو chemokine CXC) أو WKYMVm (التربتوفان ، اليس ، صور ، فال – D – الأرصاد الجوية ، والتناظرية الاصطناعية يوضع من الببتيد الجرثومي) على الأنسجة العضلية المجاورة للشعيرة وريدية في الوريد ملاحظتها. مع مرور الوقت ، ساقطا التصوير الفوتوغرافي والفيديو وبرامج الكمبيوتر ImageJ ، العدلة الزحف داخل اللمعة على البطانة ، والهجرة transendothelial العدلة والهجرة والكيميائي في الأنسجة وتصور ومجنزرة. هذا البروتوكول يسمح التحليل الكمي وموثوق بها العديد من المعلمات التوظيف العدلة مثل سرعة الزحف داخل اللمعة ، والوقت التهجير ، مفرزة الوقت والسرعة والهجرة ، وسرعة الكيميائي والكيميائي المؤشر في الأنسجة. علينا أن نظهر أن استخدام هذا البروتوكول ، ويمكن توظيف هذه المعلمات العدلة تحديد ستابلي وتنقل خلية واحدة تتبع بسهولة في الجسم الحي.

Protocol

1. جاذب كيميائي في إعداد جيل Agarose ماصة 10 مل من برنامج تلفزيوني × 2 في أنبوب 50 مل المخروطية ، والاحماء أنبوب من خلال وضعه في دورق يحتوي على ماء ساخن. ماصة 10 مل من الماء المقطر وإضافة مسحوق agarose 0.4 ?…

Discussion

Intravital المجهر هو أداة أساسية للكشف عن الآليات الخلوية والجزيئية لتجنيد الكريات البيض خلال الالتهاب. التصور الكمي لتحديد التفاعلات خلية الكريات البيض البطاني في الأنسجة microvasculature transluscent مثل العضلات والمشمرة مساريق تبقى المعيار الذهبي لتطبيق هذه التقنية 1،5. وintr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من خلال منحة بحثية من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR ، MOP – 86749). L. ليو هي المستفيدة من جائزة CIHR محقق جديد (MSH – 95374).

Materials

Table: Materials, Specific Reagents and Equipment

Name of the reagent/equipment Company Catalogue number Comments
Polyethylene tubing, PE10 Becton Dickinson 427401 I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm
India ink Speedball Art Super Black 100% carbon black pigment-no dyes
Cautery Aaron Medical AA03  
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592  
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc. DIN 01989529  
Murine recombinant MIP-2 R&D Systems 452-M2  
WKYMVm Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 072-12  
Agarose Invitrogen 15510-027 Ultrapure
Heparin Sigma H-3393  
Upright microscope Olympus BX61WI  
3CCD color video camera SONY DXC-990  
HD-DVD video recorder LG Electronics Inc. RH398H-M  
TV monitor LG Electronics Inc. 22LG30  
Water circulator Thermo Scientific HAAKE DC10  
Peristaltic pump Gilson; Pharmacia Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3  
Cremaster muscle board University of Saskatchewan   Home-made

References

  1. Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
  2. Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
  3. Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
  4. Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
  5. Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
  6. Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
  7. Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
  8. Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
  9. Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
  10. Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
  11. Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).

Play Video

Cite This Article
Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296, doi:10.3791/3296 (2011).

View Video