Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.
Abstract
Die Rekrutierung von zirkulierenden Leukozyten aus Blut, um das entzündete Gewebe ist ein wesentlicher und komplexer Prozess der Entzündung 1,2. In den postkapillären Venolen des entzündeten Gewebes, Leukozyten zunächst Leine und rollen auf der luminalen Oberfläche von venulären Wand. Rollende Leukozyten Festnahme am Endothel und unterziehen feste Verklebung als Reaktion auf Chemokin oder andere Lockstoffe auf die venulären Oberfläche. Viele adhärenten Leukozyten von der ersten Seite der Haftung auf dem junctional Extravasationsbezirks in Endothel zu verlagern, bezeichnet ein Verfahren, intraluminale kriechen 3. Nach kriechen, Leukozyten in Endothel (Seelenwanderung) bewegen und wandern in extravaskulären Gewebe in Richtung der Quelle der Lockstoff (Chemotaxis) 4. Intravitalmikroskopie ist ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung von Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen in vivo und aufschlussreich zellulären und molekularen Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten 2,5. In diesem Bericht stellen wir eine umfassende Beschreibung der Verwendung von Hellfeld Intravitalmikroskopie zu visualisieren und zu bestimmen, die genauen Abläufe des neutrophilen Rekrutierung in Maus M. cremaster in Reaktion auf den Verlauf eines Neutrophilen Lockstoff. Um neutrophilen Rekrutierung, ein kleines Stück Agarosegel (~ 1-mm Größe 3) mit neutrophilen chemoattractant MIP-2 (CXCL2, ein CXC-Chemokin) oder WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, ein synthetisches Analogon zu induzieren von bakteriellen Peptid) wird auf das Muskelgewebe neben den beobachteten postkapillären venule platziert. Mit Zeitraffer-Video Fotografie und Computer-Software ImageJ, Neutrophilen intraluminale Kriechen auf Endothel, Neutrophilen transendotheliale Migration und der Migration und Chemotaxis in Gewebe sichtbar gemacht und verfolgt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige und quantitative Analyse von vielen Neutrophilen Rekrutierung Parameter wie intraluminale krabbeln Geschwindigkeit, Seelenwanderung Zeit, Distanz Zeit, Wanderungsgeschwindigkeit, Chemotaxis Geschwindigkeit und Chemotaxis Index im Gewebe. Wir zeigen, dass dieses Protokoll verwenden, diese neutrophilen Rekrutierung Parameter stabil bestimmt werden können und die einzelne Zelle Fortbewegung bequem in vivo verfolgt.
Protocol
Discussion
Intravitalmikroskopie ist das wesentliche Werkzeug für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten während der Entzündung. Quantitative Visualisierung für die Bestimmung der Leukozyten-Endothel-Zell-Interaktionen in Mikrovaskulatur von transluzenten Gewebe wie M. cremaster und Mesenterium bleibt der Goldstandard für die Anwendung der Technik 1,5. Die konventionellen Hellfeld Intravitalmikroskopie hat viele einzigartige technische Ausstattung und die Rekrutie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium aus kanadischen Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749) unterstützt. L. Liu ist ein Empfänger CIHR New Investigator Award (MSH-95374).
Materials
Table: Materials, Specific Reagents and Equipment
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Polyethylene tubing, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm |
| India ink | Speedball Art | Super Black | 100% carbon black pigment-no dyes |
| Cautery | Aaron Medical | AA03 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murine recombinant MIP-2 | R&D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapure |
| Heparin | Sigma | H-3393 | |
| Upright microscope | Olympus | BX61WI | |
| 3CCD color video camera | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD video recorder | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| TV monitor | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Water circulator | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Peristaltic pump | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscle board | University of Saskatchewan | Home-made |
References
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