Summary

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Published: September 24, 2011
doi:

Summary

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Abstract

El reclutamiento de leucocitos circulantes del torrente sanguíneo al tejido inflamado es un proceso crucial y compleja de 1,2 inflamación. En las vénulas postcapilares de tejido inflamado, leucocitos inicialmente cuerda y rodar sobre la superficie luminal de la pared venular. Rolling arresto leucocitos en el endotelio y se someten a la adhesión firme en respuesta a quimioquinas o quimiotácticos otros en la superficie venular. Muchos leucocitos adherentes trasladarse desde el sitio inicial de la adhesión al lugar de la extravasación de la unión en el endotelio, un proceso denominado intraluminal arrastrándose 3. Después de gatear, los leucocitos se mueven a través del endotelio (transmigración) y migran en el tejido extravascular hacia la fuente de quimioatrayente (quimiotaxis) 4. Microscopia intravital es una poderosa herramienta para la visualización de las interacciones leucocito-endotelial de células in vivo y revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos 2,5. En este informe, se presenta una descripción completa de la utilización de la microscopía intravital campo claro para visualizar y determinar los procesos detallados de reclutamiento de neutrófilos en el ratón músculo cremáster en respuesta a la pendiente de un quimioatrayente de neutrófilos. Para inducir el reclutamiento de neutrófilos, un pequeño trozo de gel de agarosa (~ 1 mm de tamaño 3) con recuento de neutrófilos chemoattractant MIP-2 (CXCL2, una quimiocina CXC) o WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un análogo sintético del péptido bacteriano) se coloca en el tejido muscular adyacente a la vénula postcapilares observado. Con el tiempo transcurrido fotografía de vídeo y el ordenador el software ImageJ, el rastreo de neutrófilos intraluminal en el endotelio, la migración de neutrófilos y transendotelial la migración y la quimiotaxis de los tejidos se visualizan y seguimiento. Este protocolo permite a los análisis cuantitativos y fiables de muchos parámetros de reclutamiento de neutrófilos, tales como la velocidad de rastreo intraluminal, el tiempo de la transmigración, el tiempo de separación, la velocidad de la migración, la velocidad de la quimiotaxis y el índice de quimiotaxis en el tejido. Se demuestra que el uso de este protocolo, estos parámetros el reclutamiento de neutrófilos puede ser estable y determinado la locomoción sola célula convenientemente seguimiento en vivo.

Protocol

1. Preparación de quimioatrayente en gel de agarosa Pipeta de 10 ml de 2 × PBS en un tubo cónico de 50 ml, y calentar el tubo por ponerlo en un recipiente que contiene agua caliente. Pipeta de 10 ml de agua destilada y añadir 0,4 g de polvo de agarosa en otro tubo cónico de 50 ml (con la tapa ligeramente floja) y calentar la mezcla hasta que esté hirviendo en un horno de microondas (para ~ 1 min en un horno microondas de 700 vatios) . Agregue el calentado de 2 × PBS a la solución d…

Discussion

Microscopia intravital es la herramienta esencial para revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos durante la inflamación. Visualización para la determinación cuantitativa de las interacciones leucocito-endotelial en la microvasculatura de los tejidos translúcidos como el músculo cremáster y mesenterio sigue siendo el estándar de oro para la aplicación de la técnica de 1,5. La microscopía de campo claro intravital convencional tiene muchas características técnicas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, MOP-86749). L. Liu es un recipiente del Premio de CIHR Nueva Investigador (MSH-95374).

Materials

Table: Materials, Specific Reagents and Equipment

Name of the reagent/equipment Company Catalogue number Comments
Polyethylene tubing, PE10 Becton Dickinson 427401 I.D. 0.28mm × O.D. 0.61mm
India ink Speedball Art Super Black 100% carbon black pigment-no dyes
Cautery Aaron Medical AA03  
Xylazine Bayer HealthCare, Bayer Inc. DIN 02169592  
Ketamine hydrochloride Bioniche Animal Health Canada, Inc. DIN 01989529  
Murine recombinant MIP-2 R&D Systems 452-M2  
WKYMVm Phoenix Pharmaceuticals, Inc. 072-12  
Agarose Invitrogen 15510-027 Ultrapure
Heparin Sigma H-3393  
Upright microscope Olympus BX61WI  
3CCD color video camera SONY DXC-990  
HD-DVD video recorder LG Electronics Inc. RH398H-M  
TV monitor LG Electronics Inc. 22LG30  
Water circulator Thermo Scientific HAAKE DC10  
Peristaltic pump Gilson; Pharmacia Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3  
Cremaster muscle board University of Saskatchewan   Home-made

References

  1. Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
  2. Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).
  3. Phillipson, M. Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade. J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).
  4. Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation. Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).
  5. Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
  6. Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
  7. Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
  8. Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
  9. Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
  10. Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
  11. Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).

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Cite This Article
Xu, N., Lei, X., Liu, L. Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy. J. Vis. Exp. (55), e3296, doi:10.3791/3296 (2011).

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