Basófilos Teste de ativação de Investigação de IgE-mediada Mecanismos Hipersensibilidade a Drogas

1. Preparação de conjugados de medicamentos Dissolver 10 mg DF em 1 ml dH 2 O em um tubo de reação de 1,5 ml. No uso de prosseguir 95 mL desta solução DF. Conjugar PP para HSA dissolver 30,4 mg de derivados PP (304 g / mol) em 500 mL de hidróxido de sódio 0,3 M (NaOH). Adicionar 430,6 mL dH 2 O e 100 l 0,5 M 2 – (N-morfolino) etanosulfónico (MES) pH 6,5-95 mL de DF dissolvido. Adicionar 33,1 mL dH 2 O e 140 mL de 2 M MES pH 2,9 para a amostra PP. Adicionar 57,5 mL de uma recém-preparados N-etil-N '- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato de solução-mãe (EDC) dissolvido em dH 2 O com uma concentração de 100 mg / ml de amostra DF, ou 10 mL de solução EDC a amostra PP. Vortex as amostras para um minuto. Adicionar 16,9 ml de solução HSA com uma concentração de 118 mg / ml para cada amostra. Incubar as amostras por 2 horas em temperatura ambiente, agitando a 300 rounds / min. Diálise do DF e amostras de PP 3 vezes contra 2 litros de tampão fosfato-salina pH (PBS) 7,4 por várias horas cada. Executar todas as etapas diálise a 4 ° C. Centrifugar a amostra de 10 minutos a 14.000 xg e recolher o sobrenadante contendo DF ou PP conjugado com HSA. Verifique sobrenadante para as proteínas através da realização de um SDS-PAGE, utilizando géis de 12%. Carga de cerca de 12 microgramas de HSA conjugado em um slot de gel. 2. Determinar a taxa de acoplamento de conjugados de medicamentos (Figura 2) Para a análise da taxa de acoplamento do DF e conjugados PP por HPSEC usar um de sódio 100 mM de tampão fosfato pH 6,5 contendo NaCl 150 mM e azida sódica 0,05%. Use um x 7.8 300 milímetros TSK-Gel-G2000 coluna SWXL. Realizar a detecção de sinais usando um RI-online acoplada e um sistema de detector UV. Preparar uma amostra HSA padrão com uma concentração de 1 mg / ml em dH 2 O. Para a calibração de detector injetar 50 ul HSA solução padrão. Calcular o RI RI k constante ea UV UV k constante para o detector. Use a área de RI fórmulas = RI k * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] e área de UV UV = k * [(dA / dc) HSA * c (HSA)] com (dn / dc) HSA = 0,185 e (dA / dc) HSA = 0,518 5. Prepare DF e padrões PP derivados para HPSEC que 5, 10 e 30 nmol quantidades de ambos os padrões podem ser facilmente injetado. Calcule os valores médios de (dn / dc) de drogas e (dA / dc) de drogas para ambos os padrões. Para DF, a (dn / dc) de 0,235 ± 0,010 e um (dA / dc) de 39,000 ± 0,493 foi determinado. Para PP, a (dn / dc) de 0,328 ± 0,016 e um de (dA / dc) 53,155 ± 2,464 foi determinado. Injetar conjugados de medicamentos em HPSEC e determinar o seu RI e UV áreas dos picos. Calcular a concentração de DF, derivado PP, e HSA, resolvendo as duas equações área RI RI = k * [(dn / dc) de drogas * c (droga) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] UV área e = k UV * [(dA / dc) de drogas * c (droga) + (dA / dc) HSA * c (HSA)] para as incógnitas. 3. BAT usando conjugados de medicamentos Prepare sete taças citometria de fluxo e rotulá-las dependendo do seu conteúdo: controle sem manchas, controle negativo, controle positivo, e conjugados de drogas. Pipetar 50 ul de B-CCR-STB buffer de estimulação (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) nos frascos reservados para o controle imaculada e negativos. Como controle positivo, use 50 ul de uma solução anti-FcεRI fornecido pelo kit CAST Flow2. Adicionar as quantidades apropriadas de solução do conjugado aos frascos reservado para a conjugados de medicamentos através da criação de uma série diluição de 1:10 de 0,02 -20 mg / ml DF conjugado e PP conjugada (concentração final no ensaio de um volume de 200 mL). Estes experimentos de titulação deve ser realizada para determinar a concentração de activação de basófilos ideal para cada amostra. Adicionar 100 mL de buffer estimulação a cada tubo e sangue de 50 mL de EDTA paciente todo. Misture as amostras com cuidado. Pipetar 20 l Flow2 reagente coloração CAST contendo anticorpos anti-CCR3 marcado com ficoeritrina (PE) e anticorpos anti-CD63 marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) a cada tubo e misture novamente. Não pipetar reagentes coloração na amostra imaculada! Incubar as amostras por 45 minutos em banho-maria a 37 ° C. Reação de parada no gelo por 5 minutos. Lisar eritrócitos pela adição de 2,0 ml de reagente de lise CAST Flow2 a cada frasco e vortex suavemente. Incubar as amostras no escuro por 10 minutos em temperatura ambiente. Centrifugar amostras por 5 minutos a 500 xg eo sobrenadante cuidadosamente decantar. Ressuspender as células em 500 mL de tampão de lavagem Flow2 CAST e armazenar em gelo até citometria de fluxo. S Ajuste o citômetro de fluxo de tensãoettings para dispersão de frente e de lado (FSC, SSC), enquanto a aquisição da amostra imaculada. Porta das células como linfócitos previsto da parcela SSC-FSC para a trama SSC-PE. Basófilos são identificados por um PE-anticorpo marcado anti-CCR3 como CCR3 oi SSC lo e porta-los para o enredo FITC-PE. O anticorpo anti-CD63 detectar basófilos ativados é marcado com FITC. Definir o corte de no máximo 2,5% de basófilos CD63 como oi no controle negativo. Uma amostra é considerada positiva para a ativação de basófilos se> 5% são basófilos CD63 oi eo índice médio de fluorescência (IMF) da amostra dividido pelo MFI do controle negativo superior a 2 (Figura 3). 4. Resultados representativos: Este experimento avalia BAT como uma ferramenta útil para detectar IgE-dependente hipersensibilidade a drogas. Conjugados de proteína de AINEs são usados ​​para a ativação de basófilos. Por HPSEC com RI e do estado de agregação de detecção UV, o grau de acoplamento, e de rendimento efetivo dos conjugados são determinados. A Figura 4 mostra como, 43,5% dos conjugados DF permaneceu monomérica com um grau de acoplamento de 5,0 DF / HSA. Para os agregados um grau de acoplamento de 9,5 foi determinado. O conjugado propyphenazone mostrou consistem em monômeros 68,5% com um grau de acoplamento de 21,2. O grau de acoplamento dos agregados foi de 27,9. No total, o grau de acoplamento determinada de conjugados DF foi de 7,6 DF e que de conjugados de PP foi de 23,2. BAT realizada com conjugados em condições otimizadas (concentração de conjugados, tempo de estimulação) permitiu a investigação da IgE-dependente reações de hipersensibilidade em AINE. Conforme mostrado na Figura 5, apenas o conjugado PP foi capaz de desencadear a activação de basófilos visualizado por uma upregulation na expressão de CD63 de superfície: 20,6% de basófilos foram ativados caracterizada por uma mudança de log-in intensidade de fluorescência. A IFM aumentou por um fator de 4,9 de 386 (controle negativo) para 1893. Em contraste, usando o conjugado DF apenas 3,1% dos basófilos foram ativadas que estava abaixo dos 5% de corte. Além disso, o IFM aumentou apenas por um fator 1,1 (limite de 2.0) a partir de 197 (controle negativo) para 210. Validade do ensaio é dado por (i) <activação de basófilos 5% no controle negativo, (ii) uma mudança de log-in intensidade de fluorescência de uma subpopulação basófilos, e (iii)> 50% basófilos ativados (controle positivo). Figura 1. Acoplamento de derivados DF e PP para HSA. Depois de dissolver a droga, a água, MES buffer, e EDC (reagente de acoplamento) são adicionados. As amostras são agitadas durante 1 minuto antes HSA é pipetado para as soluções de drogas. Dentro de duas horas agitando à temperatura ambiente as drogas covalentemente se ligam a HSA. Monômeros, bem como agregados podem resultar. Figura 2. Cálculo de graus de acoplamento. Em primeiro lugar, as constantes k RI e UV k são determinados. Portanto, HSA padrão com concentração conhecida é injetada no sistema HPSEC. (Dn / dc) e (dA / dc) de HSA são dados os valores de 0,185 e 0,518, respectivamente 5. As áreas dos picos são usados ​​para calcular as constantes. Segundo, para cada três padrões de drogas são injetadas para determinar droga e da concentração específicos e áreas de RI UV. Uma vez que o RI k e constantes UV k são conhecidos a partir das etapas acima, os derivados de drogas específicas (dn / dc) e (dA / dc) pode ser calculado. Terceiro, drogas HSA conjugados são injetadas em HPSEC. As áreas dos picos resultantes são usados ​​para calcular as concentrações de drogas e por HSA de pico, resolvendo as duas equações com duas variáveis ​​desconhecidas. Figura 3. Gating Basófilo. Células previsto como linfócitos são dispersão lado gated relação ao dispersor de frente (SSC-enredo FSC). Os basófilos são identificados como CCR3 oi SSC lo a partir dos linfócitos gated (SSC-CCR3-PE enredo). Basófilos são analisados ​​para ativação (CD63 oi) na parcela CD63-FITC-CCR3-PE. O controle negativo é usado para definir o corte de no máximo 2,5% restantes basófilos CD63 oi. Figura 4. Graus de acoplamento Determinado de conjugados de medicamentos. RI e os sinais UV mostram dois picos representando agregados (eluição com um volume de retenção baixa) e monômeros (eluição com um volume de retenção de altura) de drogas HSA conjugados. Percentagens de monômeros e agregados (determinado a partir de sinais de RI) e seus graus de acoplamento são retratados (n = 1). Figura 5. Basófilo Activatiem teste. Resultados da droga conjugada ativado amostras, controles negativos e controles positivos são mostrados na CD63-FITC-CCR3-PE parcelas (n = 1).