قعدة اختبار لتنشيط التحقيق في إيج بوساطة آليات في فرط الحساسية للمخدرات
Summary
قعدة اختبار التنشيط هو أداة فعالة للكشف عن الحساسية التي تعتمد على إيج<em> في المختبر</em>. هنا ، يتم استخدام بروتوكول الأمثل لاختبار التنشيط قعدة فرط الحساسية للتحقيق في المخدرات. تم وصف طريقة لإنتاج المخدرات تقارن كفاءة البروتين التساهمية وتكييفها الفيزيائية.
Abstract
يمكن تفاعلات فرط الحساسية ضد الأدوية المضادة للالتهاب غير الستيرويدية (المسكنات) مثل propyphenazone (PP) وديكلوفيناك (مدافع) واضح ونوع I – 1 مثل الحساسية. في الممارسة السريرية ، يتم تنفيذ أساسا تشخيص فرط المخدرات عن طريق تاريخ المريض ، واختبار الجلد هو غير موثوق بها الاختبار الشفوي واستفزاز تتحمل المخاطر التي تهدد الحياة للمريض 2. وبالتالي ، فإن الأدلة لpathomechanism إيج بوساطة الكامنة من الصعب الحصول عليها.
هنا ، ونحن في أسلوب تقديم المختبر على أساس استخدام الأسسة حقوق الإنسان مستمد من مرضى الحساسية للأدوية الذي يحاكي المستجيب الحساسية في الجسم الحي. وقعدات للأدوية المرضى بالحساسية تحمل جزيئات محددة لإيج المخدرات المذنب ، أصبح عليهم تنشيط مستقبلات IgE ويشابك وإطلاق الجزيئات المستجيب للحساسية. يمكن رصد تفعيل الأسسة من عزم upregulation من سطح CD63 التعبير باستخدام التدفق الخلوي 3.
في حالة انخفاض الوزن الجزيئي المخدرات ، مصممة لتمكين تقارن إيج يشابك على مستقبلات الأسسة. كما هو مبين في الشكل (1) ، وممثلين اثنين من المسكنات وبولي بروبلين ومدافع ، لا بد أن تساهمي ألبومين المصل البشري (HSA) عن طريق مجموعة الكربوكسيل التفاعل مع المجموعة الأمينية الأساسية من بقايا يسين. مدافع يحمل مجموعة الكربوكسيل الجوهرية ، وبالتالي يمكن استخدامها مباشرة 4 ، في حين أن المجموعة التي تحتوي على مشتقات من الكربوكسيل PP كان لا بد من تجميع organochemically قبل الدراسة 1.
درجة اقتران من المركبات ذات الوزن الجزيئي المنخفض على جزيء البروتين الناقل وتوزيعها المكاني مهم لضمان يشابك اثنين من جزيئات مستقبلات IgE و. بروتوكول الموصوفة هنا ينطبق عالية الأداء اللوني الاستبعاد الحجم (HPSEC) مجهزة الإنكسار المتسلسل (RI) وفوق البنفسجي (UV) نظام الكشف عن تحديد درجة اقتران.
كما يمكن تطبيق هذه المنهجية لوصف عقاقير أخرى ، واختبار التنشيط قعدة (BAT) يحمل إمكانات ليتم استخدامها لتحديد IgE وبوساطة آليات فرط في المخدرات. هنا ، علينا أن نحدد PP فرط الحساسية وإيج بوساطة فرط الحساسية ، ومدافع عن عدم إيج بوساطة BAT.
Protocol
Discussion
BAT هي راسخة وإن لم يكن حتى الآن تستخدم بشكل روتيني طريقة لتشخيص المرض إيج بوساطة حساسية 6،7. فرط الحساسية للدواء ، ولكن ، للخطر انطباقها على المركبات منخفضة الوزن الجزيئي ليست قادرة على مستقبلات IgE وتشعبي ، وهو شرط أساسي لتفعيل قعدة 8. ولذلك ، والمخدرات ، قيد التحقيق ضرورة أن يقترن تساهميا الناقل مناسبة للبروتينات (مثل HSA). الأهم من ذلك ، لدرجة اقتران (أي عدد جزيئات الدواء في البروتين الناقل) يجب أن يكون للرقابة لضمان النشاط المناعي (IgE وأي مستقبلات عبر ربط) من تقارن. نظريا ، ينبغي أن اثنين من haptens في الجزيء الناقل تكون كافية لمستقبلات IgE وعبر ربط وثبت قليلة مثل الجزيئات مدافع خمسة في HSA لتحريك الافراج عن الوسيط في مقايسة الخلية المستندة إلى 4. وقد تم تحديد كلا تقارن ، PP – HSA وDF – HSA ، لعرض على درجة عالية بما فيه الكفاية اقتران (HPSEC) ، وتكون نشطة مناعيا الكواشف جعلها مناسبة للاستخدام في BAT. قد تكون قضية أخرى أن الأيضات المخدرات قد تلعب دورا ، وذلك بدلا من المستقلب المخدرات الأم قد يسبب رد فعل حساسية. في حالة وجود مدافع ، وقد تم تقييم هذا الاحتمال بالتفصيل به سابقا five المرحلة الرئيسية الأيضات أنا واحد مغاير الربط 4. عوامل هامة لاتقان تقنية صفها تشمل جودة عينة من الدم (<12 ساعة منذ جمع الدم ، والكشف عن عدد من قعدات> 500) وتحسين ظروف التحفيز (الوقت والجرعة). بالإضافة إلى ذلك ، ما يسمى غير المستجيبين الذين لا تتفاعل حتى مع السيطرة الايجابية (الأجسام المضادة الموجهة ضد مستقبلات إيج) يتعين تحديدها. ولذلك ، ومعايير يجب أن تتضمن التحقق من صحة جسم مكافحة FcεRI كما تحكم إيجابية. ميزة هامة من استخدام تقارن المخدرات هو حقيقة أنها غير سامة تظهر على النقيض من العقاقير نقية ، كما هو موضح لDF – HSA المتقارن بواسطة التحفيز بالتعاون مع المضادة للأجسام المضادة في FcεRI BAT 4. مدافع نقية ، في المقابل ، يعرض الآثار السامة للخلايا عند تركيز من 1.25 ملغ / مل يسبب مشاكل مع تفسيرها من BAT 9. عموما ، ينصح بشدة لاختبار السمية المحتملة لكل المتقارن المخدرات المنتجة حديثا.
هنا ، لقد أظهرنا إمكانات PP – HSA المتقارن BAT المستخدمة في الكشف عن فريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة فرط الحساسية. في المقابل ، لا يرتبط مع مدافع فرط IgE وأثبت عدم وجود تفعيل قعدة ردا على DF – HSA المتقارن. الأهم من ذلك ، في حالة من عدم اليقين بشأن آلية إيج بوساطة ، تقارن يتعين تقييمها لنشاط المناعية التي كتبها في أنظمة الفحص المختبري خلية القاعدة كما تبين للمدافع 4.
باستخدام الإعداد لوصف العقاقير التصريف منخفضة الوزن الجزيئي لتساهميا البروتين الناقل مناسبة جزيئات عددا من تفاعلات فرط الحساسية ضد الأدوية بما فيها المضادات الحيوية ، المسكنات الأخرى ، radiocontrast وسائل الإعلام ، مرخيات العضلات ، والتخدير ، قد يكون التحقيق وما إلى ذلك للحصول على اشتراك لفريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة الآلية. وبالتالي ، قد يكون بمثابة BAT بالإضافة إلى الأساليب الحالية لتشخيص (اختبار الجلد ، واختبار الاستفزاز عن طريق الفم).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق العلوم النمساوية (FWF) منحة P18820 – B13.
أخلاقيات البيان :
تمت الموافقة على الدراسة (PLUS_Ethik_090514) من قبل لجنة أخلاقيات التجارب التي تجرى على البشر و / أو الحيوانات في جامعة سالزبورغ الامتثال للDeclaraction هلسنكي بصيغته المعدلة في عام 1983 ، وجميع المرضى المشاركين أعطت موافقتها على علم مكتوب.
Materials
| Name of the reagent/device | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M3671 | – |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Bioscience | 08540 | – |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | 338962 | – |
| Bench top centrifuge | Sigma | – | – |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | D6899 | – |
| EDTA-Vacutainer | Becton Dickinson | 368589 | – |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett Packard | – | – |
| Human Serum Albumin | Sigma | A9511 | – |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | – | – |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma | E6383 | – |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | – |
| Propyphenazone derivative | Department of Molecular Biology, University of Salzburg, Austria | – | – |
| Shaker | Eppendorf | – | – |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | – |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma | 90421C | – |
| Sodium hydroxid | Sigma | S5881 | – |
| Sodium phosphate | Sigma | 342483 | – |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | – |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | – |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | – |
References
- Himly, M. IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone. J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).
- Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. Important questions in Allergy: 1–drug allergy/hypersensitivity. Allergy. 63, 616-619 (2008).
- Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).
- Harrer, A. Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites. PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).
- De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).
- Ebo, D. G. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61, 1028-1039 (2006).
- Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils. Curr Med Chem – Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).
- Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).
