薬物過敏症におけるIgEが介在する機序の解明のための好塩基球の活性化試験

1。薬物コンジュゲートの調製 1.5 mlの反応チューブに10 mgのDF 1ミリリットルのdH 2 Oに溶解する。さらに先に進むには、このDFのソリューションの95μlを使用してください。 HSAにPPコンジュゲートするには、500μlの0.3 Mの水酸化ナトリウム（NaOH）の30.4 mgをPP誘導体（304 g /モル）を溶​​解する。 （N -モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）緩衝液に溶解したDFの6.5から95μlを- 430.6μLのdH 2 Oと100μlの0.5Mの2を追加。 PPのサンプルに33.1μLのdH 2 Oおよび2 M MES緩衝液pH 2.9の140μlを添加する。 新しく調製したN -エチル- N'の57.5μlを加え、 – DFのサンプル〜100 mg / mlの、またはに10μlのEDC溶液の濃度とOのdH 2に溶解した（3 -ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）ストック溶液PPのサンプル。ボルテックスで1分間のサンプル。 各サンプル〜118 mg / mlの濃度でHSA溶液の16.9μlを加え。 300ラウンド/分で振とうしながら室温で2時間サンプルをインキュベートする。 数時間ごとにDFとPPのサンプルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.4の2リットルに対して3回透析。 4℃で、すべての透析の手順を実行します。 14,000 xgでサンプル10分間遠心し、上清を含むDFまたはHSAに結合したPPを収集する。 12％ゲルを用いて、SDS – PAGEを行うことにより、タンパク質の上清を確認してください。 oneゲルのスロットにHSA抱合体の約12μgをロードします。 2。薬物複合体の結合率を決定する（図2） HPSECでDFとPPの複合体の結合率の分析のために150mMのNaCl及び0.05％アジ化ナトリウムを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5を使用してください。 7.8 × 300ミリメートルTSK – GEL – G2000 SWXLの列を使用してください。 オンライン結合RIとUV検出器システムを使用して信号の検出を行います。 のdH 2 O中に1 mg / mlの濃度でHSAの標準サンプルを準備する検出器のキャリブレーションのために50μlのHSAの標準溶液を注入する。 RI定数kのRIおよび検出器のためのUV定数kのUVを計算する。式の領域のRIを使用= k個のRI * [（DN / DC）HSA * C（HSA）]とエリアUV = K UV * [（DA / DC）HSA * C（HSA）]と（DN / DC）HSA = 0.185と（DA / DC）HSA = 0.518 5。 DFとの両方の規格の5、10、および30 nmol収量を容易に注入できることをHPSEC用PP派生規格を準備します。 薬と両方の規格のための（DA / DC） 薬 （DN / DC）の値を平均計算する。 DFの場合は、39.000の0.235の（DN / DC）± 0.010と（DA / DC）± 0.493を決定した。 PPの場合は、53.155の0.328の（DN / DC）± 0.016と（DA / DC）± 2.464を決定した。 HPSECの薬物複合体を注入し、それらのRIとUVピーク面積を決定する。 = kのRI * [（DN / DC） 薬 * C（薬）+（DN / DC）HSA * C（HSA）]とエリアのUV二つの方程式の領域のRIを解くことによってDF、PP誘導体、およびHSAの濃度を計算する= K UV * [（DA / DC） 薬 * C（薬）+（DA / DC）HSA * C（HSA）]未知数のため。 3。薬物複合体を使用してBAT sevenフローサイトメトリーのバイアルを準備し、その内容に応じて、それらにラベルを付ける：未染色のコントロール、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、および薬物複合体を。 ピペット染色およびネガティブコントロール用に予約されたバイアルにB – CCR – STBの刺激バッファー（Flow2 CAST、Bühlmann研究所、Schönenbuch、CH）の50μlの。ポジティブコントロールとして、Flow2 CASTキットで提供される抗FcεRI溶液50μlを使用してください。 0.02 -20μg/ mlのDF共役とPP共役（200μlのアッセイ体積中の最終濃度）から1:10希釈系列を作成することにより、薬物複合体のために予約バイアルに共役ソリューションの適切な量を追加。これらの滴定実験は、各患者サンプルに対して最適な好塩基球活性化の濃度を決定するために実行する必要があります。 各チューブに、50μlの患者のEDTA全血に100μlの刺激のバッファを追加。慎重にサンプルを混ぜる。 ピペット20μlのFlow2 CAST染色コエリスリン（PE）と各チューブにフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識した抗CD63抗体で標識した抗CCR3抗体を含む試薬、再度混ぜる。未染色標本に染色試薬をピペッティングしないでください！ 37℃の水浴中で45分間サンプルをインキュベートする。 5分間氷上で反応を停止します。 静かに各バイアルおよび渦に試薬を溶解し2.0ミリリットルFlow2のCASTを追加することにより、赤血球を溶解する。室温で10分間暗所でサンプルをインキュベートする。 5 500 × gで分間、注意深く上清をデカントのためにサンプルを遠心する。 フローサイトメトリーするまで氷上で500μlのFlow2 CASTの洗浄バッファーとストア内の細胞を再懸濁する。 フローサイトメーターの電圧sを調整する前方および側方散乱光（FSC、SSC）のためのettings未染色標本を獲得しながら。 ゲートのセルは、SSC – FSCのプロットからSSC – PEのプロットへのリンパ球として予測。好塩基球は、CCR3 ハイ SSC LOとゲートそれらのFITC – PEのプロットになど、PE標識抗CCR3抗体によって識別されます。活性化好塩基球を検出する抗CD63抗体は、FITCで標識されている。 ネガティブコントロールにおけるCD63 HIと好塩基球の最大カットオフ2.5％を設定します。 > 5％の好塩基球は、CD63 hiおよびネガティブコントロールのMFIで割ったサンプルの平均蛍光インデックス（MFI）2を超える（図3）である場合、サンプルは、好塩基球活性化のために正とみなされます。 4。代表的な結果： この実験では、IgE依存性の薬物過敏症を検出するために有益なツールとしてBATを評価します。非ステロイド性抗炎症薬の蛋白質複合体は、好塩基球の活性化のために使用されています。 RIとUV検出の凝集状態、結合度、および結合体の効果的な利回りとHPSECによって決定されます。 図4に示すように、DFの複合体の43.5％、5.0 DF / HSAの結合度を持つ単量体であった。凝集体のために9.5の結合度を決定した。 propyphenazone複合体は、21.2の結合度と68.5％のモノマーから成ることが示された。凝集体の結合度は27.9であった。合計では、DFの複合体の決定結合度は7.6 DFとPPの複合体のそれは23.2であった。 BATはNSAID過敏症におけるIgE依存性反応の調査を許可されて最適化された条件下での抱合体（抱合体の濃度、刺激時間）で行う。好塩基球の20.6％が活性化された蛍光強度の対数変化によって特徴づけ： 図5に示すように、唯一のPP複合体は、好塩基球活性化はCD63の表面発現のアップレギュレーションにより視覚誘発することができた。 MFIは1893年に386（ネガティブコントロール）から4.9倍増加した。対照的に、好塩基球のDF共役を使用すると、は3.1％が5％未満にオフカットされた活性化した。また、MFIは197（ネガティブコントロール）から210に係数1.1（上限2.0）でのみ増加した。アッセイの妥当性は、<好塩基球の亜集団の蛍光強度の（ⅱ）ログシフト、および（iii）、陰性対照の5％好塩基球の活性化> 50％活性化好塩基球（陽性対照）（i）で与えられる。 図1。HSAにDFとPP誘導体のカップリング。溶解後の薬剤、水、MES緩衝液、およびEDC（カップリング試薬）が追加されます。 HSAは、薬剤のソリューションにピペッティングする前にサンプルを1分間ボルテックスしている。室温で振盪しながら2時間以内に薬は共有結合HSAに結合する。モノマーと同様に凝集が発生する可能性があります。 図2。結合度の計算。最初に、RIとK UV K定数が決定されます。したがって、既知の濃度のHSAの標準は、HPSECシステムに注入される。 （DN / DC）とHSAの（DA / DC）がそれぞれ5、0.185と0.518の値が与えられます。ピーク面積は、定数を計算するために使用されています。第二に、各薬物のための3つの基準は、薬物と濃度固有のRIとUV領域を決定するために注入されています。 k個のRIとK UVの定数は上記の手順から知られているので、薬剤固有の（DN / DC）と（DA / DC）の誘導体は、計算することができます。第三に、薬剤HSAコンジュゲートは、HPSECに注入されています。結果として得られるピーク面積は、2つの未知変数を持つ2つの方程式を解くことにより、ピークあたりの薬剤とHSAの濃度を計算するために使用されています。 図3。好塩基球のゲーティング。リンパ球は前方散乱対ゲート側方散乱（SSC – FSCプロット）であるため、細胞が予測している。好塩基球は、ゲートリンパ球（SSC – CCR3 – PEプロット）からCCR3 ハイ SSC LOとして識別されます。好塩基球は、CD63 – FITC – CCR3 – PEのプロットの活性化（CD63 HI）について分析する。ネガティブコントロールは、CD63 hiを残りの最大2.5％の好塩基球のカットオフを設定するために使用されます。 図4。薬物複合体の決定結合度。 RIとUVの信号は、薬物 – HSA複合体の凝集体（低保持容量で溶出）および単量体を（高い保持容量で溶出）を表す2つのピークを示す。単量体と凝集体（RIシグナルから決定）とそれらの結合度のパーセンテージは、（N = 1）描かれています。 図5。好塩基球activatiテストで。薬物複合体活性化サンプル、ネガティブコントロール、ポジティブコントロールの結果は、CD63 – FITC – CCR3 – PEのプロット（N = 1）で示されています。