L'attivazione dei basofili di prova per le Indagini di IgE-mediata Meccanismi di ipersensibilità a farmaci

1. Preparazione di coniugati farmaco Sciogliere 10 mg DF in 1 ml di dH 2 O in una provetta da 1,5 ml di reazione. Nel procedere ulteriormente uso 95 ml di questa soluzione DF. A coniugare PP HSA sciogliere 30,4 mg di derivati ​​PP (304 g / mol) in 500 microlitri 0,3 M di idrossido di sodio (NaOH). Aggiungi 430,6 microlitri dH 2 O e 100 l 0,5 M 2 – (N-morfolino) etano acido (MES) pH 6,5-95 l di DF sciolto. Aggiungi 33,1 microlitri dH 2 O e 140 ml di 2 M MES tampone pH 2,9 a campione PP. Aggiungere 57,5 ml di uno preparati al momento N-etil-N '- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) soluzione madre sciolto in dH 2 O con una concentrazione di 100 mg / ml al campione DF, o 10 ul di soluzione EDC per PP campione. Vortex i campioni per 1 minuto. Aggiungere 16,9 ml di soluzione di HSA con una concentrazione di 118 mg / ml per ogni campione. Incubare i campioni per 2 ore a temperatura ambiente agitando a 300 giri / min. Dializzare il DF e campioni di PP 3 volte contro le 2 litri di soluzione salina tampone fosfato (PBS) pH 7,4 per diverse ore ciascuno. Eseguire tutti i passaggi dialisi a 4 ° C. Centrifugare il campione 10 minuti a 14.000 xg e raccogliere il supernatante contenente DF o PP coniugato con HSA. Controllare surnatante per le proteine ​​eseguendo un SDS-PAGE, utilizzando il 12% gel. Carico di circa 12 mg di HSA coniugato in uno slot gel. 2. Determinare il tasso di accoppiamento di coniugati farmaco (Figura 2) Per l'analisi del tasso di accoppiamento del DF e PP coniugati da HPSEC utilizzare una di sodio 100 mM tampone fosfato pH 6,5 contenente 150 mM di NaCl e sodio azide 0,05%. Utilizzare un 7,8 x 300 mm TSK-Gel-G2000 colonna SWXL. Eseguire il rilevamento dei segnali utilizzando un line-coupled RI e rivelatore sistema UV. Preparare un campione standard di HSA con una concentrazione di 1 mg / ml in DH 2 O. Per la calibrazione del rivelatore iniettare 50 microlitri HSA soluzione standard. Calcolare la costante k RI RI e UV UV costante k per il rivelatore. Utilizzare l'area formule RI RI = k * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] e l'area UV UV = k * [(dA / dc) HSA * c (HSA)] con (dn / dc) HSA = 0,185 e (dA / dc) HSA = 0,518 5. Preparare DF e PP standard derivati ​​HPSEC che ammonta 5, 10 e 30 nmol di entrambi gli standard possono essere facilmente iniettato. Calcolare i valori medi per (dn / dc), di droga e (dA / dc), farmaco per entrambi gli standard. Per DF, un (dn / dc) di 0,235 ± 0,010 e un (dA / dc) di 39,000 ± 0,493 è stato determinato. Per PP, una (dn / dc) di 0,328 ± 0,016 e un (dA / dc) di 53,155 ± 2,464 è stato determinato. Iniettare coniugati farmaco su HPSEC e determinare la loro RI e UV aree dei picchi. Calcolare la concentrazione di DF, derivati ​​PP e HSA risolvendo l'area due equazioni RI RI = k * [(dn / dc) Farmaco * c (droga) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] e UV zona UV = k * [(dA / dc) Farmaco * c (droga) + (dA / dc) HSA * c (HSA)] per le incognite. 3. BAT utilizzando coniugati farmaco Preparare sette coppe citometria a flusso e etichettarli a seconda del loro contenuto: controllo senza macchia, controllo negativo, controllo positivo, e coniugati droga. Pipettare 50 ml di B-CCR-STB buffer di stimolazione (FLOW2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) nel fiale riservato per il controllo senza macchia e negativo. Come controllo positivo, utilizzare 50 ml di un anti-FcεRI soluzione fornita dal kit FLOW2 CAST. Aggiungere la quantità appropriata della soluzione di coniugato alla fiale riservato ai coniugati farmaco creando una serie diluizione 1:10 da 0,02 -20 mg / ml DF coniugato e PP coniugato (concentrazioni finali in un volume dosaggio di 200 l). Questi esperimenti di titolazione devono essere eseguiti per determinare la concentrazione ottimale di attivazione dei basofili per ogni campione del paziente. Aggiungere 100 microlitri di buffer stimolo a ciascuna provetta con EDTA e sangue intero 50 microlitri del paziente. Mescolare accuratamente i campioni. Pipettare 20 l FLOW2 colorazione CAST reagente contenente anticorpi anti-CCR3 marcati con ficoeritrina (PE) e anti-CD63 anticorpi marcati con isotiocianato di fluorescina (FITC) per ciascuna provetta e mescolare nuovamente. Non pipettare colorazione del reagente nel campione senza macchia! Incubare i campioni per 45 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Fermare la reazione in ghiaccio per 5 minuti. Lisi degli eritrociti con l'aggiunta di 2,0 ml di reagente di lisi CAST FLOW2 ad ogni flacone e agitare delicatamente. Incubare i campioni al buio per 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni per 5 minuti a 500 xg e decantare il surnatante con cura. Risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer FLOW2 CAST lavare e conservare il ghiaccio fino citometria a flusso. S Regolare la tensione della citometria a flusso dimpostazioni per scatter in avanti e laterale (FSC, SSC) durante l'acquisizione del campione senza macchia. Porta le cellule come linfociti previsto dalla SSC-FSC complotto per la SSC-PE trama. Basofili sono identificati da un PE con etichetta anti-CCR3 anticorpi come CCR3 hi SSC lo e li porta nel FITC-PE trama. L'anticorpo anti-CD63 rilevazione basofili attivati ​​è marcato con FITC. Impostare il cut-off ad un massimo del 2,5% dei basofili come CD63 hi nel controllo negativo. Un campione è considerato positivo per l'attivazione dei basofili se basofili> 5% sono CD63 hi e l'indice medio di fluorescenza (MFI) del campione divisa per la MFI del controllo negativo supera i 2 (Figura 3). 4. Rappresentante dei risultati: Questo esperimento valuta BAT come uno strumento utile per rilevare IgE-dipendente ipersensibilità a farmaci. Coniugati proteina di FANS sono utilizzati per l'attivazione dei basofili. Da HPSEC con RI e rilevamento dello stato di aggregazione UV, il grado di accoppiamento, e la resa effettiva dei coniugati sono determinati. Come mostra la Figura 4 mostra, il 43,5% dei coniugati DF è rimasto monomerica con un grado di accoppiamento su 5,0 DF / HSA. Per gli aggregati un grado di accoppiamento di 9,5 è stata determinata. Il coniugato propyphenazone è stato dimostrato che consistono di monomeri 68,5% con un grado di accoppiamento di 21,2. Il grado di accoppiamento degli aggregati è stato 27,9. In totale, il grado di accoppiamento determinato di coniugati DF DF è stata di 7,6 e quello di coniugati PP era 23.2. BAT eseguita con coniugati in condizioni ottimizzate (concentrazione di coniugati, il tempo di stimolazione) indagine ha permesso di IgE-dipendente reazioni di ipersensibilità FANS. Come mostrato nella Figura 5, solo il PP coniugato è stato in grado di innescare l'attivazione dei basofili visualizzati attraverso un up-regolazione dell'espressione di CD63 di superficie: 20,6% dei basofili sono stati attivati ​​caratterizzati da un log-shift di intensità di fluorescenza. La IFM aumentato di un fattore pari a 4,9 da 386 (controllo negativo) al 1893. Al contrario, utilizzando il coniugato DF solo 3,1% dei basofili sono stati attivati, che era inferiore al 5% di cut-off. Anche la IFM è aumentato solo di un fattore 1,1 (limite 2,0) da 197 (controllo negativo) a 210. Validità del test è dato da (i) <5% di attivazione dei basofili nel controllo negativo, (ii) un log-spostamento di intensità di fluorescenza di una sottopopolazione basofili, e (iii)> 50% basofili attivati ​​(controllo positivo). Figura 1. Accoppiamento di derivati ​​DF e PP di HSA. Dopo aver sciolto le droghe, l'acqua, MES buffer e EDC (reagenti di accoppiamento) sono aggiunti. I campioni sono in agitazione per 1 minuto prima di HSA è pipettati alle soluzioni droga. Entro 2 ore agitazione a temperatura ambiente i farmaci si legano covalentemente alla HSA. Monomeri così come aggregati può causare. Figura 2. Calcolo dei gradi di accoppiamento. In primo luogo, le costanti k RI e UV k sono determinati. Pertanto, HSA standard con concentrazione nota viene iniettato nel sistema HPSEC. (Dn / dc) e (dA / dc) di HSA sono riportati i valori di 0,185 e 0,518, rispettivamente 5. Le aree dei picchi sono utilizzati per calcolare le costanti. In secondo luogo, per ciascun farmaco viene iniettato tre standard per determinare droga e la concentrazione specifici per aree di RI e ai raggi UV. Dato che il RI k UV e le costanti k sono noti i passaggi precedenti, i derivati ​​farmaco-specifici (dn / dc) e (dA / cc) può essere calcolato. In terzo luogo, droga HSA coniugati vengono iniettate nel HPSEC. Le aree dei picchi risultanti vengono utilizzati per calcolare le concentrazioni di farmaco e HSA al picco risolvendo le due equazioni con due incognite. Figura 3. Gating basofili. Cellule come linfociti sono previsti side scatter gate contro forward scatter (SSC-plot FSC). I basofili sono identificati come CCR3 hi SSC lo dai linfociti gated (SSC-CCR3-PE trama). I basofili sono analizzati per l'attivazione (CD63 hi) nel CD63-FITC-CCR3-PE trama. Il controllo negativo viene utilizzato per impostare il cut-off del massimo basofili 2,5% rimanente CD63 hi. Figura 4. Gradi di accoppiamento determinato di coniugati farmaco. RI e segnali UV mostrano due picchi che rappresentano aggregati (eluizione a volume di ritenzione basso) e monomeri (eluizione a volume di ritenzione di altezza) di farmaco-HSA coniugati. Percentuali di monomeri e aggregati (determinata dai segnali RI) e le loro gradi di accoppiamento sono rappresentati (n = 1). Figura 5. Basofili Activatiin prova. Risultati di farmaco coniugato attivato campioni, controlli negativi e controlli positivi sono mostrati in CD63-FITC-CCR3-PE trame (n = 1).