Basophil מבחן הפעלה לחקירות IgE בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר
Summary
מבחן Basophil ההפעלה הוא כלי רב עוצמה לצורך זיהוי של IgE תלויי אלרגיות<em> במבחנה</em>. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה עבור מבחן ההפעלה basophil משמש לחקור רגישות יתר בסמים. שיטה לייצור יעיל של סמים חלבון conjugates קוולנטיים ואפיון physicochemical שלהם מתואר.
Abstract
תגובות רגישות יתר כנגד סטרואידיות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) כמו propyphenazone (PP) ו – diclofenac (DF) יכול להתבטא סוג אני כמו תגובות אלרגיות 1. בפועל קליני, אבחון של רגישות יתר בסמים מתבצע בעיקר על ידי ההיסטוריה המטופל, כמו בדיקות העור אינו אמין בדיקות פרובוקציה אוראלי דובים מסכני חיים סיכונים עבור 2 המטופל. לפיכך, עדות pathomechanism IgE בתיווך הבסיסית קשה להשיג.
כאן, אנו מציגים שיטה חוץ גופית מבוסס על שימוש של בזופילים האדם הנגזרות סמים רגישות יתר המטופלים המחקה את התגובה האלרגית מפעיל in vivo. כפי בזופילים של סמים אלרגית חולים לשאת מולקולות IgE ספציפי לתרופה האשם, הם הופכים להיות מופעל על crosslinking קולטן IgE ולשחרר מולקולות מפעיל אלרגית. הפעלה של בזופילים יכול להיות פיקוח על ידי קביעת upregulation הביטוי CD63 פני השטח באמצעות זרימת cytometry 3.
במקרה של תרופות נמוך משקל מולקולרי, conjugates נועדו לאפשר crosslinking IgE קולטן על בזופילים. כמתואר באיור 1, שני נציגים של NSAIDs, PP ו DF, מחויבים קוולנטית אל אלבומין בסרום אדם (HSA) באמצעות קבוצת carboxyl מגיבים עם קבוצת אמינו ראשונית של שאריות ליזין. DF נושאת קבוצה carboxyl מהותי, ולכן ניתן להשתמש ישירות 4, בעוד קבוצה המכילים carboxyl נגזרת של PP חייב להיות מסונתז organochemically לפני המחקר 1.
מידת הצימוד של תרכובות נמוך משקל מולקולרי על מולקולת חלבון המוביל הפריסה המרחבית שלהם חשוב להבטיח crosslinking של שתי מולקולות IgE הקולטן. פרוטוקול המתואר כאן חל כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים בגודל הרחקה (HPSEC) מצויד עם מקדם שבירה רציפים (RI) אולטרה סגול (UV) מערכת זיהוי לקביעת מידת צימוד.
כפי המתודולוגיה המתוארת ניתן להחיל על תרופות אחרות, המבחן ההפעלה basophil (BAT) נושא את פוטנציאל לשמש לקביעת IgE בתיווך מנגנונים רגישות יתר בסמים. כאן, אנו קובעים PP רגישות כמו בתיווך IgE ו רגישות יתר DF כלא IgE מתווכת על ידי BAT.
Protocol
Discussion
BAT היא מבוססת היטב אף שעדיין לא בשימוש שגרתי שיטה לאבחון של מחלות אלרגיות בתיווך IgE 6,7. עבור רגישות יתר בסמים, עם זאת, ישימותה נפגעת כמו תרכובות משקל מולקולרי נמוך אינם מסוגלים קולטנים crosslink IgE, תנאי מוקדם להפעלת basophil 8. לכן, תרופות תחת חקירה צריך להיות יחד קוולנטית לחלבונים מנשא מתאים (למשל HSA). חשוב לציין, מידת צימוד (כלומר מספר של מולקולות התרופה לכל חלבון המוביל) צריך להיות בשליטה כדי להבטיח את פעילות מערכת החיסון (כלומר, הקולטן IgE cross-linking) של conjugates. באופן תיאורטי, שני haptens לכל מולקולה הספק צריך להיות מספיק עבור קולטן IgE cross-linking ומעטים כמו חמש מולקולות DF לכל HSA הוכחו ההדק לשחרר המתווך assay מבוססי תאים 4. Conjugates שני, PP-HSA ו DF-HSA, נקבעו כדי להציג תואר צימוד גבוה מספיק (HPSEC) ולהיות פעיל immunologically שהופך אותם ריאגנטים מתאים לשימוש BAT. בעיה נוספת עשויה להיות כי מטבוליטים התרופה עשויה לשחק תפקיד, כמו המטבוליט במקום סמים ההורה עלול לגרום תגובת רגישות יתר. במקרה של DF, אפשרות זו נבדקה בהרחבה בעבר באמצעות five שלב חשוב אני מטבוליטים ואחד גרסה הצמדה 4. גורמים חשובים עבור Mastering את הטכניקה המתוארת כוללים איכות דגימת דם (<12 שעות מאז איסוף דם, מספר בזופילים זוהה> 500) ואופטימיזציה של תנאים גירוי (מנה זמן). בנוסף, מה שנקרא לא מגיבים שאפילו לא מגיבים עם שליטה חיובית (נוגדנים כנגד הקולטן IgE) צריך להיות מזוהה. לכן, קריטריון האימות חייב לכלול נוגדן אנטי FcεRI כביקורת חיובית. יתרון חשוב של השימוש בסמים conjugates היא העובדה שהן מופיעות רעיל בניגוד סמים טהור, כפי שמוצג על ידי גירוי בשיתוף עם נוגדן אנטי FcεRI בבת 4 עבור DF-HSA המצומד. Pure DF, לעומת זאת, מציגה השפעות ציטוטוקסיות בריכוז של 1.25 מ"ג / מ"ל גורם לבעיות עם interpretability של בת 9. בדרך כלל, בדיקות רעילות פוטנציאלית מומלץ מאוד עבור המצומד כל סם הפיק החדש.
הנה, הראינו את הפוטנציאל של PP-HSA המצומד בשימוש BAT לחשוף IgE בתיווך רגישות יתר. לעומת זאת, DF רגישות יתר אינה קשורה IgE שמפגינים חוסר הפעלת basophil בתגובה DF-HSA המצומד. חשוב לציין, במקרה של חוסר ודאות לגבי מנגנון IgE בתיווך, conjugates צריך להיות מוערך על פעילות מערכת החיסון על ידי במערכות assay במבחנה מבוססי תאים כפי שהוכח על DF 4.
באמצעות התקנה של תיאר conjugating תרופות משקל מולקולרי נמוך קוולנטית למוביל מולקולות חלבון מתאים מספר של תגובות רגישות יתר כנגד תרופות כולל אנטיביוטיקה, NSAIDs אחרים, radiocontrast התקשורת, מרפי שרירים, הרדמה וכו 'עלול להיחקר על מעורבותם של IgE בתיווך מנגנון. לפיכך, BAT עשוי לשמש בנוסף את השיטות הקיימות לאבחון (מבחן עור, פרובוקציה אוראלי בדיקות).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי קרן המדע האוסטרי (FWF) מענק P18820-B13.
אתיקה הצהרה:
המחקר אושר (PLUS_Ethik_090514) על ידי ועדת האתיקה לניסויים עירוב בני אדם ו / או בעלי חיים באוניברסיטת זלצבורג ציות Declaraction הלסינקי כמו מתוקנת בשנת 1983, כל החולים שהשתתפו נתן הסכמה מדעת בכתב שלהם.
Materials
| Name of the reagent/device | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M3671 | – |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Bioscience | 08540 | – |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | 338962 | – |
| Bench top centrifuge | Sigma | – | – |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | D6899 | – |
| EDTA-Vacutainer | Becton Dickinson | 368589 | – |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett Packard | – | – |
| Human Serum Albumin | Sigma | A9511 | – |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | – | – |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma | E6383 | – |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | – |
| Propyphenazone derivative | Department of Molecular Biology, University of Salzburg, Austria | – | – |
| Shaker | Eppendorf | – | – |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | – |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma | 90421C | – |
| Sodium hydroxid | Sigma | S5881 | – |
| Sodium phosphate | Sigma | 342483 | – |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | – |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | – |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | – |
References
- Himly, M. IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone. J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).
- Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. Important questions in Allergy: 1–drug allergy/hypersensitivity. Allergy. 63, 616-619 (2008).
- Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).
- Harrer, A. Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites. PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).
- De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).
- Ebo, D. G. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61, 1028-1039 (2006).
- Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils. Curr Med Chem – Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).
- Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).
