İlaç Aşırı duyarlılık IgE aracılığı ile Mekanizmalarının Araştırılması bazofil Etkinleştirme Test
Summary
Bazofil aktivasyon testi, IgE bağımlı alerji tespiti için güçlü bir araçtır<em> In vitro</em>. Burada, bazofil aktivasyon testi için optimize edilmiş bir protokol ilaç aşırı duyarlılık araştırmak için kullanılır. Kovalent ilaç-protein konjugatları ve fizikokimyasal karakterizasyonu ve verimli üretim için bir yöntem açıklanmıştır.
Abstract
Propyphenazone (PP) ve diklofenak (DF) gibi non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID) karşı aşırı duyarlılık reaksiyonları, alerjik reaksiyonlar 1 I-benzeri türü olarak tezahür edebilir . Klinik uygulamada, ilaç aşırı duyarlılık tanısı deri testleri güvenilir değildir ve oral provokasyon testi 2 hasta için hayatı tehdit eden riskler taşımaktadır esas olarak hastanın öyküsü tarafından yapılır. Dolayısıyla, altta yatan bir IgE aracılı pathomechanism delil elde etmek zordur.
Burada, in vitro yöntem, ilaca duyarlı hastalarda in vivo olarak, alerjik efektör reaksiyon taklit edilen insan bazofiller kullanımına dayalı bir sunuyoruz. Ilaç alerjik hastalarda bazofil suçlu ilaç için spesifik IgE molekülleri taşıyan, IgE reseptörü crosslinking üzerine aktif ve alerjik effektör moleküllerin serbest hale gelir. Bazofil aktivasyonu CD63 yüzey ekspresyonu flow sitometri 3 kullanarak upregülasyonu belirlenmesi ile takip edilebilir.
Düşük molekül ağırlıklı ilaçların durumunda, konjugatları bazofiller IgE reseptörü crosslinking sağlamak için tasarlanmıştır. Şekil 1, iki temsilci NSAİİ tasvir gibi, PP ve DF, bir karboksil grubu ile lizin kalıntılarının temel amino grubu ile reaksiyona Kalkış Desteği (HSA) insan serum albumini için kovalent bağlıdırlar. DF, bir karboksil grubu içeren PP türevi organochemically önce çalışma 1 sentezlenebilir sahipken, bu nedenle, doğrudan 4 kullanılabilir içsel bir karboksil grubu ve taşımaktadır .
Iki IgE reseptör molekülleri crosslinking garanti etmek için protein taşıyıcı molekül düşük molekül ağırlıklı bileşikler ve mekansal dağılımının kaplin derece önemlidir. Burada açıklanan protokol sıralı bir kırılma indeksi (RI) ve ultraviyole (UV) kaplin derecesinin belirlenmesi için algılama sistemi ile donatılmış yüksek performans boyut dışlama kromatografisi (HPSEC) geçerlidir.
Açıklanan metodoloji diğer ilaçlar için uygulanan olabilir, bazofil aktivasyon testi (BAT), ilaç aşırı duyarlılık IgE aracılı mekanizmaların belirlenmesi için kullanılan olma potansiyeli taşımaktadır. Burada, PP aşırı duyarlılık IgE aracılı ve DF aşırı duyarlılık, BAT, non-IgE aracılı olarak belirlemek.
Protocol
Discussion
BAT iyi kurulmuş henüz IgE aracılı allerjik hastalık 6,7 tanısı için rutin olarak kullanılan yöntem olsa da. Ilaç aşırı duyarlılık için düşük molekül ağırlıklı bileşikler çapraz IgE reseptörleri, bazofil aktivasyon 8 için bir ön koşul değildir, ancak, bunun uygulanabilirliği tehlikeye düşer. Bu nedenle, soruşturma altında ilaçların kovalent uygun taşıyıcı proteinler (örneğin HSA) ile birleştiğinde olması gerekir. Daha da önemlisi, kaplin derecesi (yani taşıyıcı protein başına ilaç moleküllerinin sayısı) konjugatları (yani IgE reseptörü cross-linking) immünolojik aktivite garanti etmek için kontrol edilmesi gerekiyor. Teorik olarak, taşıyıcı molekül başına iki hapten IgE reseptörü için yeterli olmalıdır çapraz bağlama ve HSA başına beş DF molekülleri gibi birkaç hücre bazlı analiz 4 mediatör salınımını tetikler görülmüştür. Her iki konjugatları, PP-HSA ve DF-HSA, yeterince yüksek bir bağlantı derecesi (HPSEC) gösterilecek ve onlara BAT kullanım için uygun reaktifler immünolojik etkin olacak şekilde tespit edilmiştir. Bir diğer sorun, ana ilacın yerine metaboliti olarak aşırı duyarlılık reaksiyonuna neden olabilir, ilaç metabolitleri bir rol oynayabilir olabilir. DF durumunda, bu olasılığı daha önce beş büyük Faz I metabolitleri ve bir bağ varyant 4 kullanılarak ayrıntılı olarak değerlendirilmiştir . Açıklanan teknik mastering için önemli faktörler kan örneği (<kan toplama, tespit bazofiller sayısı bu yana 12 saat> 500) ve stimülasyon koşullarının optimizasyonu (zaman, doz) kalite içerir. Buna ek olarak, bu bile pozitif kontrol (antikor IgE reseptörü yöneltilen) tespit edilmesi ile reaksiyona girmeyen olmayan-yanıt olarak adlandırılır. Bu nedenle, doğrulama kriterleri, pozitif kontrol olarak bir anti-FcεRI antikor dahil etmek zorunda. Ilaç konjugatları kullanarak önemli bir avantajı DF-HSA konjuge anti-BAT 4 FcεRI antikor ile birlikte stimülasyon için gösterilen saf ilaçlar, aksine non-toksik ortaya çıktığı bir gerçektir. Saf DF, aksine, 1.25 mg / ml konsantrasyonda BAT 9 yorumlanabilirliğini sorunlara neden sitotoksik etkileri gösterir. Genel olarak, potansiyel sitotoksisite test kuvvetle her yeni üretilen ilaç bileşimi için tavsiye edilir.
Burada, BAT IgE aracılı aşırı duyarlılık ortaya çıkarmak için kullanılan PP-HSA konjuge potansiyel göstermiştir. Buna karşılık, DF aşırı duyarlılık DF-HSA konjuge yanıt bazofil aktivasyon eksikliği gösterdiği IgE ile ilişkili değildir. Önemlisi, IgE aracılı bir mekanizma ile ilgili belirsizlik durumunda, konjugatları DF 4 gösterildiği gibi, in vitro hücre tabanlı test sistemleri immünolojik aktivite için değerlendirilmek üzere.
Uygun protein taşıyıcı kovalent düşük molekül ağırlıklı ilaçların conjugating açıklanan kurulumu kullanarak, antibiyotikler de dahil olmak üzere ilaç, diğer NSAID, radiocontrast medya, kas gevşeticiler, anestezi karşı aşırı duyarlılık reaksiyonları bir dizi moleküller, vb IgE aracılıklı bir katılımı için soruşturma olabilir mekanizması. Bu nedenle, BAT tanı (cilt testi, oral provokasyon testi) mevcut yöntemlere ek olarak hizmet verebilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu'nun (FWF) hibe P18820-B13 tarafından finanse edildi.
Etik bir bildirimde:
Çalışma, 1983 yılında gözden geçirilmiş ve katılan tüm hastaların yazılı bilgilendirilmiş onam verdi Helsinki Declaraction uygun Salzburg Üniversitesi, İnsanlar ve / veya Hayvanlar katılımı Deneyler (PLUS_Ethik_090514) Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
Materials
| Name of the reagent/device | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M3671 | – |
| 7.8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL column | Tosoh Bioscience | 08540 | – |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | 338962 | – |
| Bench top centrifuge | Sigma | – | – |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | D6899 | – |
| EDTA-Vacutainer | Becton Dickinson | 368589 | – |
| Flow2 CAST Kit | Bühlmann Laboratories | FK-CCR | Effective June 14, 2011 Flow2 CAST kit is now Flow CAST |
| HP1100 HPLC system | Hewlett Packard | – | – |
| Human Serum Albumin | Sigma | A9511 | – |
| Laboratory centrifuge | Eppendorf | – | – |
| N-Ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma | E6383 | – |
| PBS tablets | AppliChem | A9199 | – |
| Propyphenazone derivative | Department of Molecular Biology, University of Salzburg, Austria | – | – |
| Shaker | Eppendorf | – | – |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | – |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | – |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma | 90421C | – |
| Sodium hydroxid | Sigma | S5881 | – |
| Sodium phosphate | Sigma | 342483 | – |
| Triple detector array | Viscotek | TDA302 | – |
| Personal BioVortex V-1 plus | Peqlab | 90-V-1 | – |
| Water bath 1012 | GFL | 1012 | – |
References
- Himly, M. IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone. J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).
- Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. Important questions in Allergy: 1–drug allergy/hypersensitivity. Allergy. 63, 616-619 (2008).
- Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).
- Harrer, A. Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites. PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).
- De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues. J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).
- Ebo, D. G. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives. Allergy. 61, 1028-1039 (2006).
- Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils. Curr Med Chem – Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).
- Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).
