Lectina a base di isolamento e la coltura del mouse motoneuroni embrionali
Summary
Un modo alternativo di isolare motoneuroni embrionali di topo dal midollo spinale è descritto. Il metodo tiene conto del fatto che lectine possono legarsi a bassa affinità dei recettori nervosi p75NTR fattore di crescita. Questo lectina-based preplating permette una purificazione simile a quella con un anticorpo specifico contro il p75NTR.
Abstract
Motoneuroni spinali sviluppare verso postmitotic ai primi stadi dello sviluppo embrionale del sistema nervoso e, successivamente, crescono dendriti e degli assoni. Neuroepiteliale cellule del tubo neurale che esprimono Nkx6.1 sono le cellule precursore unico per motoneuroni spinali 1. Anche se motoneuroni postmitotic verso la loro posizione finale e si organizzano in colonne lungo il tratto della colonna vertebrale 2,3. Più del 90% di tutti questi motoneuroni differenziata e posizionata esprimere i fattori di trascrizione Islet 1 / 2. Essi innervano i muscoli degli arti così come quelli del corpo e gli organi interni. Tra gli altri, i motoneuroni tipicamente esprimono il recettore ad alta affinità per il fattore neurotrofico cervello derivato (BDNF) e neurotrofina-3 (NT-3), la tropomiosina legate chinasi B e C (TrkB, TRKC). Essi non esprimono la tropomiosina legati chinasi A (TrkA) 4. Accanto ai due recettori ad alta affinità, motoneuroni non esprimono il recettore a bassa affinità neurotrofina p75 NTR. La p75 NTR può legare tutte le neurotrofine con simile affinità, ma inferiore a tutte le neurotrofine che i recettori ad alta affinità che legano le neurotrofine maturo. All'interno del midollo spinale embrionale, la p75 NTR è esclusivamente espressa dal motoneuroni spinali 5. Questo è stato utilizzato per sviluppare tecniche di isolamento dei motoneuroni per purificare le cellule dalla stragrande maggioranza delle cellule circostanti 6. Motoneuroni isolando con l'ausilio di anticorpi specifici (panning) contro il dominio extracellulare di p75 NTR si è rivelato essere un metodo costoso come la quantità di anticorpi utilizzati per un singolo esperimento è alta a causa delle dimensioni del piatto usato per il panning. Un'alternativa molto più economica è l'uso di lectina. Lectina è stato dimostrato che si legano specificamente a p75 NTR pure 7. Il metodo che segue descrive una tecnica alternativa utilizzando agglutinina germe di grano per una procedura preplating invece che l'anticorpo p75 NTR. La lectina è un'alternativa estremamente economico per l'anticorpo p75 NTR ed i gradi di purificazione con lectina è paragonabile a quella degli anticorpi p75 NTR. Motoneuroni del midollo spinale embrionale può essere isolata da questo metodo, sopravvivere e crescere i neuriti.
Protocol
Discussion
Il vantaggio di questa tecnica basata lectina preplating è che è meno costoso del NTR a base di p75 procedura di panning, e la lectina è più stabile di anticorpi. L'arricchimento elencati nella fig. 2 e tab. 1 mostra che la procedura consente alla purificazione di un numero simile di cellule e che la maggior parte di queste cellule esprimono il marcatore motoneuroni Islet-1 / 2. La fase più critica è la procedura di isolamento per il midollo spinale lombare. Rimuovendo le meningi e il DRG (Fig. 2) è essenziale per la procedura di purificazione seguenti lectina-based preplating. Se questa è stata gestita correttamente, quasi tutte le cellule esprimono la p75 NTR (per quadro rappresentativo vedi fig. 3a). Il motivo della differenza tra l'espressione di Islet-1 / 2 e p75 NTR è più probabilmente perché motoneuroni lombari differenziale esprimere livelli superiori e inferiori di Islet-1 / 2 10. In caso di bassi livelli di Islet-1 / 2 questa espressione potrebbe essere sfuggito la nostra attenzione nella colorazione immuncytochemical e contando successive come siamo stati rigorosi rispetto a cellule positive rispetto al negativo (Tab. 1). Inoltre, la tabella 1 mostra chiaramente che le cellule isolate sopravvivere alla procedura in una condizione di buona salute, in quanto vi sono solo poche cellule positive trypan-blu che indicano che le cellule sono irreversibilmente danneggiate. Questa procedura consente anche alterative isolamento dei motoneuroni da embrioni singolo e quindi di cucciolate genotipo misti dai topi embrionale. In conclusione, questa alternativa alla procedura panning con l'anticorpo p75 NTR 6 ha capacità simili se non identici, in termini di campi di possibile applicazione e fornisce un metodo economico ed efficiente alternativa per la purificazione motoneuroni embrionali di topo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Sandra Bargen per un eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal reparto di ricerca Protein (PRD, TP A1.2 (RC e TS), e la ricerca RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Gli anticorpi monoclonali 39.4D5 e F55A10 sono stati ottenuti da studi sullo sviluppo Ibridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | Gibco | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo | Ø 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma | L5142 | |
| Cell culture dish | Nunc | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 |
Table 3. Table of specific reagents and equipment.
References
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