Lectine à base d'isolement et de la culture des motoneurones embryonnaires de la souris

Pour les réactifs spéciaux: voir Tab. 1. Tous les autres réactifs sont mentionnés dans la qualité de grade culture cellulaire obtenue chez Sigma Aldrich. 1. Revêtement PORN-H/laminin des plats / lamelles Préparer la solution de travail de 0,5 mg / ml de poly-DL-ornithine bromhydrate (PORN-H) dans 150 mM de tampon borate de pH 8,35. Une solution stock de 50 mg PORN / 1 ml de tampon borate peut être préparé à l'avance et stocké à -20 ° C. Stériliser lamelles de verre à la flamme dans l'éthanol 100% et laissez-les sécher à l'air. Couvrir la surface avec suffisamment de porn-H solution de nuit à 4 ° C. Le lendemain laver trois fois avec de l'eau stérilisée et sécher à l'air des lamelles. Préparer la solution de travail de 2,5 pg / ml de laminine dans HBSS Aliquotes peuvent être stockés à -20 ° C. Décongeler à 4 ° C immédiatement avant l'utilisation. Couvrir la surface du couvre-PORNO-H-revêtu de la solution la laminine et les laisser incuber pendant au moins 2 h à température ambiante jusqu'à utilisation. 2. Revêtement de lectine de la plaque d'épuration Préparer une solution de Tris 10 mM dans de l'eau stérilisée, pH 9,5. Ajouter lectine (résoudre la lectine (Sigma L9640) de poudre dans HBSS) à une concentration finale de 10 pg / ml. Enduire la surface d'un plat de 10 cm de culture cellulaire avec 8 ml de la solution de lectine et laisser incuber pendant au moins 30 min à température ambiante. Laver la plaque trois fois avec HBSS et stocker dans HBSS jusqu'à utilisation. Préparer un 30 mM KCl, 0,8% (p / v) de NaCl dépolarisation-solution. Stériliser par filtration et stocker à température ambiante (RT). 3. Milieu de culture des motoneurones Cheval de dégeler le sérum nuit à 4 ° C et inactiver à 55 ° C pendant 30 min, Aliquoter en 5 ml et conserver à -20 ° C. Aliquote de dégel directement avant de l'utiliser à température ambiante. Boutique B27-supplément dans une aliqouts ml à -20 ° C. Dégel B27 complément à la température ambiante immédiatement avant utilisation. Éviter les cycles de gel et de dégel. Glutamax Aliquoter en aliquots de 0,5 ml et conserver à -20 ° C et l'utiliser à 1:100. Préparer une solution stock de 10 ug / ml dans le CNTF eau stérilisée avec la BSA à 0,1%. Conserver à -20 ° C. Mélangez 46 ml de milieu neurobasal avec 2,5 ml de sérum de chevaux, 1 ml B27-complément et 0,5 ml glutamax directement avant l'utilisation. Ajouter CNTF à une concentration finale de 10 ng / ml de milieu et préchauffer à moyen et à 37 ° C. 4. Dissection de la moelle épinière Sacrifice d'une souris E12.5 enceintes et enlever les embryons soigneusement. Ajouter suffisamment RT HBSS pour couvrir complètement les embryons. Retirez la tête et la queue et le lieu de la face arrière d'embryon avec des membres enfourché. Fixer l'embryon avec une pince et retirer la peau externe avec la pince d'autres. Retirer la moelle épinière en perçant la pince sous lui et il lève avec les mouvements de scie des deux côtés de la moelle épinière. Transférer la moelle épinière isolée d'un nouveau plat avec HBSS et ouvrir le canal central de la moelle épinière sur la face dorsale. Retirez les ganglions rachidiens en supprimant les méninges entourant la moelle épinière. Ramassez les pièces lombaire de la moelle épinière de jusqu'à 6 embryons par plaque lectine dans un tube de réaction Eppendorf remplis avec HBSS 1 ml et stocker sur la glace jusqu'à ce que la préparation est faite. 5. Enrichissement des motoneurones par la lectine à base de purification Remarque: Avant de commencer les prochaines étapes, la dernière ici, préparer et préchauffer le support (voir l'étape 3.) Préparer une solution de trypsine par la résolution 1 g de trypsine dans du HBSS de 100 ml, conserver à -20 ° C et laisser décongeler à 4 ° C. Mélanger 1g trypsine-inhibiteur avec 98 ml de HBSS et 2 ml d'une M pH 7,4 HEPES, aliquotes de 1 ml doivent être conservés à 4 ° C. Transférer le tube avec la moelle épinière d'une hotte de culture cellulaire et retirez soigneusement 700 pl de la HBSS. Ajouter 7,5 ul solution de trypsine et mélanger en inversant le tube soigneusement. Effectuer trypsination pendant 8 min à 37 ° C. Arrêter la réaction par addition de 30 ul inhibiteur de la trypsine et la pipette de haut en bas (triturer) attentivement 10-15 fois avec une pointe de pipette 1000 ul jusqu'au agrégats cellulaires sont plus visibles. Répétez la trituration avec une pipette de 20 à 200 ul et la pointe correspondante. Pipeter la solution de cellules dans la plaque HBSS rempli de lectine et de disperser les cellules en faisant tourner la plaque. Conservez la plaque lectine pendant 60 min à température ambiante sur une surface exempte de vibrations. Couvrir pour éviter toute contamination. Retirez le HBSS très doucement et laver soigneusement la plaque 4 fois avec préchauffé HBSS pour éliminer les fragments de cellules et les cellules non attachées / seules. Immédiatement après la dernière étape de lavage, ajouter 500 ul solution de dépolarisation de la plaque et laisser incuber pendant 1min. Faciliter le détachement des cellules lectine liée par des tremblements etfrappant la plaque. Remplir la plaque avec 2 ml milieu de culture pré-chauffé et le transfert d'un tube Falcon de 15 ml. Comptez le nombre de cellules avec une chambre de comptage Neubauer. Assiette de la cellule sur les lamelles de la laminine enduits ou plaques dans un nombre approprié selon l'application. Effectuer un échange de support le jour 1 et ensuite tous les deux jours par remplacement minutieuse de 50% de l'ancien milieu. Toujours utiliser des pré-chauffée, un milieu fraîchement préparé une nouvelle culture. 6. Les résultats représentatifs: Motoneurones embryonnaires peuvent être obtenues à partir d'embryons de souris à E12 à E14. 2-3% de la population totale des cellules de la moelle épinière lombaire se compose des motoneurones et les neurones ganglionnaires de la racine dorsale sont p75 NTR-positifs ainsi, il est important de se débarrasser de ces cellules avant de commencer la procédure preplating lectine base ( Pour un aperçu voir Figure 1 et Figure 2). Deuxièmement, les méninges notamment des cellules fortement divisant qui devraient être exclus aussi, comme ils ne peuvent pas être correctement supprimés par la procédure preplating lectine base (Figure 2 et Figure 3). Dans le pire des cas, ces cellules peuvent proliférer les plaques de culture. Les images représentant la figure 3B et 3D aussi donner une impression sur la plus faible densité cellulaire après le lavage des procédures ont été effectuées (voir l'étape 5.9 du protocole). Les cultures de motoneurones embryonnaires de souris sont généralement maintenues jusqu'à cinq ou sept jours. Durant cette période, les cellules établissent leurs neurites jusqu'à une longueur maximale (figure 4). Longueurs neurites dépendent fortement du substrat sur ​​les 8 assiettes. Le substrat typique est la laminine qui est couché sur porn-H boîtes de culture couverte. Motoneurones peuvent également se développer sur d'autres substrats ou moins définis, comme les matrices extracellulaires générés par 8 lyse de l'eau. En cas de revêtement, la longueur des neurites et la zone sous-optimale du cône de croissance sont réduites et la mort cellulaire augmente habituellement. Support trophique joue un rôle crucial pour la survie des motoneurones embryonnaires de souris en culture. La survie des cellules initialement plaqué sur sept jours chuter à 10% à 20% sans appui 6 trophiques. Facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et le facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) sont les facteurs les plus couramment utilisés mais d'autres peuvent favoriser la survie aussi bien [facteur inhibiteur de leucémie (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9]. Schéma de la figure 1. Pour la préparation des motoneurones embryonnaires de souris. Le schéma illustre les différentes étapes pour l'isolement et la culture des motoneurones embryonnaires de souris. Abréviations: SC: la moelle épinière; HBSS: solution saline équilibrée de Hanks, MN: motoneurone. Figure 2: Isolement de la partie lombaire de la moelle épinière de souris E12.5 A:.. E12.5 embryon de souris. Pour l'étape suivante, la tête et la queue sont supprimés et le corps est placé dans une position dorsale B-up: l'embryon dans une position dorsale-up. Pince à gauche et à droite de la moelle épinière sont la fixation du corps de l'embryon dans sa position. Un des forceps est ensuite utilisé pour couper la peau et à réduire au-dessous de la moelle épinière que l'autre est utilisée pour fixer l'embryon dans sa position C:. Isolé de la moelle épinière à partir d'embryons de souris E12.5. Les parties de la moelle épinière (cervicale, thoracique, lombaire) sont indiqués. La moelle épinière est entourée par les méninges et une partie du ganglion de la racine dorsale encore y attacher D:. La moelle épinière est coupé longitudinalement sur ​​la face dorsale de l'ouvrir vers le canal central E:. Les méninges sur la face ventrale sont maintenant prises hors de la moelle épinière aplati. Note: Bien pris son envol, la partie lombaire est marquée par une petite coupure F:. Seule la partie lombaire de la moelle épinière est alors pris pour d'autres procédures. Figure 3: Détermination et l'isolement des îlots de cellules positives de la moelle épinière lombaire des embryons de souris E12.5 A:.. Les étiquettes Islet-1 / 2 d'anticorps colonnes motoneurone dans la moelle épinière lombaire embryonnaire (rouge, flèche) et des étiquettes Hoechst tous les noyaux au sein de la section. Coupe transversale d'un cordon Lumar E12.5 épinière. E12.5 embryons de souris ont été fixés dans l'immersion-paraformaldéhyde à 4% pendant 6 h, lavée 3 fois avec du tampon phosphate salin et traitée avec du saccharose selon des procédures standard. Cryocoupes de 20 um ont été prises avec un cryostat et les sections ont été traitées pour la coloration immunohistochimique selon les procédures habituelles 11. Les sections Ware suite étiqueté avec Hoechst pour la localisation des noyaux cellulaires. Notez queles neurones ganglionnaires de la racine dorsale sont Islet-1/2-positive ainsi et que la procédure de préparation des pièces exclut ce tissu de la procédure d'isolement B:. Islet-1 / 2 étiquetés (rouge, flèche) dissocié lombaires cellules de la moelle épinière du E12. 5 embryons, gauche – avant et à droite – après lectine basé preplating. Les cellules ont été contre-colorées avec Hoechst pour visualiser tous les noyaux des cellules C:. Quantification des cellules Islet-1/2-positive avant et après la lectine à base preplating D:. Nkx6.1 motoneurones marqué à partir de E12.5 embryons après une journée dans la culture. Les cellules ont été contre-colorées avec Hoechst pour cisualieze tous les noyaux. Notez que 90% de toutes les cellules sont Nkx6.1 positif. Abréviations: SC: la moelle épinière; MN: motoneurone; DRG: ganglion de la racine dorsale. Figure 4 Caractérisation des motoneurones de souris E12.5 A et B:.. Enrichi isolées de souris E12.5 motoneurones spinaux lombaires exprimer p75 NTR à 0 jours in vitro (0div) et le jour 2 in vitro (2div). Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% et ensuite colorées pour p75 NTR conformément aux procédures standard. Les cellules ont été contre l'aide de Hoechst pour visualiser tous les noyaux C:. Motoneurones Enrichi après 5 jours in vitro (5div) sur porn-H et la laminine comme substrats de culture et en présence de vitraux pour la CNTF β-III-tubuline. Notez que les cellules se sont développées hors neurites longs et afficher la morphologie du motoneurone typique avec un plus long (ramifié) processus et un ou plusieurs processus plus courts (axones et dendrites). Abréviations: MN: motoneurone; div: jours in vitro. Après la dissociation sans lectine basé preplating Le nombre total de cellules / SC Bleu Trypan de cellules positives [%] Cellules positives Islet-1/2- [%] 1 995,0 13,1 9,5 2 889,4 8,0 10,0 3 1.180.0 11,0 10,8 Moyenne ± SD 1.021.0 147,1 ± 10,7 ± 2,6 10,1 ± 0,7 Avec lectine basé preplating Nombre de cellules après preplating / SC Bleu Trypan de cellules positives [%] Cellules positives Islet-1/2- [%] 1 189,6 9,9 70,5 2 168,8 3,7 76,1 3 125,0 0,0 72,5 Moyenne ± SD 161,1 ± 33,0 4,5 ± 5,0 73,0 ± 2,8 Tableau 1. Sommaire des résultats des procédures d'isolement représentant de motoneurones embryonnaires de souris du stade E12.5. À partir de 3 différentes procédures d'isolement spécialement à cet effet sont donnés comme le nombre total ou les numéros de pourcentage ± SD. Abréviation: LC: la moelle épinière; SD: déviation standard. Islet-1 / 2 cellules positives avec p75 panoramique [%] Islet-1 / 2 cellules positives avec la lectine basée panoramique [%] 92,0 ± 3,5 1 73,0 ± 2,8 Tableau 2. Résultats de comparaison de lectine à base et p75-1 à base de panoramiques nombre de cellules des motoneurones. Numéros sont donnés à titre pourcentage ± SD.