Lectine-based Isolatie en cultuur van de muis embryonale motoneuronen
Summary
Een alternatieve manier van isoleren van muis embryonale motorneuronen van het ruggenmerg wordt beschreven. De methode houdt rekening met het feit dat de lectine kan binden aan de lage affiniteit zenuw groeifactor receptor p75NTR. Deze lectine-based preplating kan een zuivering vergelijkbaar met die met een specifiek antilichaam tegen de p75NTR.
Abstract
Spinal motoneuronen ontwikkelen in de richting postmitotische stadia vroege embryonale ontwikkeling van het zenuwstelsel en vervolgens uitgroeien dendrieten en axonen. Neuro-epitheliale cellen van de neurale buis die uitdrukken Nkx6.1 zijn de unieke voorloper cellen voor spinale motoneuronen 1. Hoewel postmitotische motoneuronen de richting van hun definitieve standpunt en zichzelf te organiseren in kolommen langs de spinale kanaal 2,3. Meer dan 90% van al deze gedifferentieerde en gepositioneerd motoneuronen uiten de transcriptiefactoren Islet 1 / 2. Ze innerveren de spieren van de ledematen als die van het lichaam en de inwendige organen. Onder andere motorneuronen meestal uiten de hoge affiniteit receptoren voor de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) en neurotrofine-3 (NT-3), de tropomyosine-gerelateerde kinase B en C (TrkB, TrkC). Ze drukken niet de tropomyosine-gerelateerde kinase A (TrkA) 4. Naast de twee hoge affiniteit receptoren, doe motoneuronen drukken de lage affiniteit neurotrofine p75 NTR. De p75 NTR kunnen binden alle neurotrofinen met soortgelijke maar een lagere affiniteit voor alle neurotrofinen dan de hoge affiniteit receptoren zou binden de volwassen neurotrofinen. Binnen de embryonale ruggenmerg, is de p75 NTR uitsluitend uitgedrukt door de wervelkolom motoneuronen 5. Deze is gebruikt om motoneuron isolatie technieken te ontwikkelen om de cellen van de overgrote meerderheid van de omringende cellen 6 te zuiveren. Isoleren van motorneuronen met de hulp van specifieke antilichamen (panning) tegen de extracellulaire domeinen van de p75 NTR heeft bleek een dure methode als de hoeveelheid van de antistof gebruikt voor een enkel experiment is hoog vanwege de grootte van de plaat wordt gebruikt voor panning worden. Een veel goedkoper alternatief is het gebruik van lectine. Lectine is aangetoond dat specifiek te binden aan p75 NTR ook 7. De volgende werkwijze beschrijft een alternatieve techniek met behulp van tarwekiemen agglutinine voor een preplating procedure in plaats van de p75 NTR antilichaam. De lectine is een zeer goedkoop alternatief voor de p75 NTR antilichaam en de zuivering met behulp van cijfers lectine zijn vergelijkbaar met die van de p75 NTR antilichaam. Motoneuronen van de embryonale ruggenmerg kunnen worden geïsoleerd door deze methode, te overleven en te groeien uit neurieten.
Protocol
Discussion
Het voordeel van deze lectine-based preplating techniek is dat het minder duur dan de p75 NTR-based panning procedure, en de lectine is stabieler dan antilichamen. De verrijking die in Fig. 2 en Tab. 1 laat zien dat de procedure maakt het mogelijk om de zuivering van vergelijkbare aantallen cellen en dat een meerderheid van deze cellen drukken de motoneuron marker Islet-1 / 2. De meest kritische stap is de isolatie procedure voor de lumbale ruggenmerg. Het verwijderen van de hersenvliezen en de DRG's (afb. 2) is essentieel voor de volgende zuivering procedure door lectine-based preplating. Als dit correct is geslaagd, bijna alle cellen drukken de p75 NTR (voor representatief beeld zie Fig. 3a). De reden voor het verschil tussen expressie van Islet-1 / 2 en p75 NTR is waarschijnlijk omdat lumbale motoneuronen verschillend uiten hogere en lagere niveaus van Islet-1 / 2 10. In het geval van lage niveaus van Islet-1 / 2 expressie dit zou kunnen zijn ontsnapt onze aandacht in de immuncytochemical vlekken en de daaropvolgende tellen als wij waren streng met betrekking tot de positieve versus negatieve cellen (tabel 1). Bovendien, Tabel 1 toont duidelijk aan dat de geïsoleerde cellen de procedure te overleven in een gezonde toestand, want er zijn slechts weinig trypan-blauw positieve cellen die aangeven dat de cellen onherstelbaar beschadigd zijn. Deze alteratief procedure maakt het ook mogelijk isolatie van motoneuronen van single embryo's en dus ook van gemengde genotype nesten van embryonale muizen. Kortom, dit alternatief voor de panning procedure met de p75 NTR antilichaam 6 is vergelijkbaar met of zelfs identiek zijn capaciteiten op het gebied van de mogelijke toepassingen bereiken en biedt een goedkoop en efficiënt alternatief zuiveringsmethode voor de muis embryonale motoneuronen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Sandra Bargen voor een uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de research afdeling Protein (PRD, TP A1.2 (RC en TS), en de RUB Research Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) De monoklonale antilichamen 39.4D5 en F55A10 werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | Gibco | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo | Ø 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma | L5142 | |
| Cell culture dish | Nunc | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 |
Table 3. Table of specific reagents and equipment.
References
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
