Lectin القائم على عزل وثقافة حركية مماثلة الجنينية الماوس
Summary
ووصف طريقة بديلة لعزل العصبونات الحركية الفأر الجنينية من الحبل الشوكي. الأسلوب يأخذ في الاعتبار حقيقة أن lectin يمكن ربط العصب تقارب منخفضة p75NTR مستقبلات عوامل النمو. هذا preplating lectin المستندة يسمح تنقية مماثلة لتلك التي مع الأجسام المضادة المحددة ضد p75NTR.
Abstract
العصبونات الحركية في العمود الفقري نحو تطوير المراحل الجنينية المبكرة تالية للتفتل من خلال تطوير النظام العصبي ، وتنمو في وقت لاحق من التشعبات والمحاور. خلايا عصبية ظهارية من الأنبوب العصبية التي تعبر عن Nkx6.1 هي الخلايا السليفة فريدة للعصبونات حركية الشوكي 1. على الرغم من التحرك نحو حركية مماثلة تالية للتفتل موقفهم النهائي وتنظيم أنفسهم في أعمدة على طول المسالك 2،3 الشوكي. أكثر من 90 ٪ من كل هذه العصبونات الحركية متباينة ، ووضع تعبير عن عوامل النسخ جزيرة 1 / 2. انهم يعصب عضلات الاطراف وكذلك من الجسم والأجهزة الداخلية. من بين أمور أخرى ، أعرب العصبونات الحركية عادة مستقبلات عامل تقارب عالية للعصبية في الدماغ مشتقة (BDNF) وNeurotrophin 3 (NT – 3) ، والتروبوميوزين ذات الصلة كيناز باء وجيم (TrkB ، TrkC). انها لا تعبر عن كيناز التروبوميوزين المتصلة A 4 (TrkA). بجانب مستقبلات two تقارب عالية ، والعصبونات الحركية لا تعبر عن انخفاض مستقبلات neurotrophin تقارب NTR P75. يمكن ربط جميع NTR P75 neurotrophins مع تقارب مماثلة لكنها أقل لجميع neurotrophins من المستقبلات عالية تقارب وربط neurotrophins ناضجة. داخل النخاع الشوكي الجنينية ، وأعرب عن حصرا NTR P75 من العصبونات الحركية في العمود الفقري 5. وقد استخدمت هذه المعرفة لتطوير تقنيات العزل العصبون الحركي لتنقية الخلايا من الغالبية العظمى من الخلايا المحيطة 6. تحولت عزل العصبونات الحركية مع مساعدة من أضداد محددة (بالغسل) ضد من المجالات خارج الخلية P75 NTR إلى أن تكون وسيلة مكلفة وكمية الأجسام المضادة المستخدمة في تجربة واحدة هي عالية نظرا لحجم لوحة المستخدمة لبالغسل. وثمة بديل أكثر اقتصادا هو استخدام lectin. وقد تبين Lectin ربط خصيصا لP75 NTR فضلا 7. الأسلوب التالي يصف أسلوب بديل باستخدام القمح الجرثومية راصة لإجراء preplating بدلا من الأضداد NTR P75. وlectin هو بديل رخيص الثمن للغاية على الضد NTR P75 وتنقية الصفوف باستخدام lectin مماثلة لتلك التي في جسم NTR P75. يمكن عزل العصبونات الحركية من الحبل الشوكي الجنينية باستخدام هذا الأسلوب ، البقاء والنمو خارج neurites.
Protocol
Discussion
ميزة هذه التقنية preplating lectin المستندة هو أنه أقل تكلفة من الإجراء NTR المستندة P75 بالغسل ، وlectin هي أكثر استقرارا من الأجسام المضادة. إثراء المدرجة في الشكل. (2) وتبويب. 1 يبين أن الإجراء يسمح لتنقية عدد مماثل من الخلايا وأن غالبية هذه الخلايا تعبر عن علامة العصبون الحركي جزيرة – 1 / 2. الخطوة الأكثر أهمية هو الإجراء لعزل النخاع الشوكي القطني. إزالة السحايا وDRGs في (الشكل 2) أمر ضروري لتنقية الإجراء التالي lectin المستندة preplating. إذا كان قد نجح هذا صحيح ، وتقريبا جميع خلايا تعبر عن NTR P75 (صورة لممثل انظر الشكل 3A). سبب الفرق بين التعبير عن جزيرة – 1 / 2 وP75 NTR هو على الارجح بسبب التعبير عن حركية مماثلة القطني تفاضليا المستويات العليا والدنيا للجزيرة 1 / 2 10. في حالة وجود مستويات منخفضة من جزيرة 1 – التعبير / 2 قد هربوا هذا اهتمامنا في تلطيخ immuncytochemical والفرز اللاحقة كما كنا صارمة فيما يتعلق الخلايا إيجابية في مقابل سلبية (Tab. 1). بالإضافة إلى ذلك ، ويبين الجدول 1 بوضوح أن الخلايا المعزولة الإجراء البقاء في حالة صحية جيدة ، وهناك عدد قليل فقط التريبان الأزرق الخلايا الإيجابية التي تشير إلى أن تلف الخلايا بشكل لا رجعة فيه. هذا الإجراء بديل يسمح أيضا عزل العصبونات الحركية من أجنة واحدة ، وبالتالي من الفضلات الوراثي مختلطة من الفئران الجنينية. في الختام ، هذا البديل إلى إجراء بالغسل مع الضد NTR P75 6 ومتشابهة إن لم تكن متطابقة من حيث القدرات النطاقات الممكنة التطبيق ويوفر طريقة فعالة ورخيصة بديلة لتنقية العصبونات الحركية الفأر الجنينية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ساندرا Bargen حصول على الدعم الفني الممتاز. وأيد هذا العمل من قبل إدارة البحوث البروتين (PRD ، TP A1.2 (RC وTS) ، ومولعا RUB البحوث وRektoratsprogramme — wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) وتم الحصول على الاجسام المضادة و39.4D5 F55A10 من ورم هجين دراسات الإنمائية بنك (DSHB ، مدينة أيوا ، IA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | Gibco | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo | Ø 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma | L5142 | |
| Cell culture dish | Nunc | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 |
Table 3. Table of specific reagents and equipment.
References
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
