לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים
Summary
דרך אלטרנטיבית של בידוד motoneurons עכבר עובריים מן חוט השדרה מתואר. השיטה לוקחת בחשבון את העובדה לקטינים יכולים לאגד את הזיקה נמוך עצב p75NTR גורם הגדילה לקולטן. זה preplating לקטינים מבוססי מאפשרת טיהור דומה לזה עם נוגדן ספציפי נגד p75NTR.
Abstract
Motoneurons השדרה לפתח לקראת שלבי postmitotic דרך התפתחות מערכת העצבים העוברית המוקדמת, ולאחר מכן לצמוח מתוך דנדריטים ואקסונים. תאים Neuroepithelial של הצינור העצבי המבטאים Nkx6.1 הם תאים מבשר ייחודי motoneurons השדרה 1. למרות motoneurons postmitotic לנוע לעבר עמדתו הסופית שלהם להתארגן עמודות לאורך בדרכי השדרה 2,3. יותר מ -90% מכלל אלה motoneurons הבדיל ואת מיקומו לבטא את גורמי השעתוק איילט 1 / 2. הם innervate את שרירי הגפיים, כמו גם אלה של הגוף ואת האיברים הפנימיים. בין היתר, motoneurons בדרך כלל להביע את הקולטנים זיקה גבוהה עבור גורם נגזר neurotrophic במוח (BDNF) ו Neurotrophin-3 (NT-3), tropomyosin הקשורות קינאז B ו-C (TrkB, TrkC). הם אינם מבטאים את קינאז tropomyosin הקשורות (TrkA) 4. לצד שני קולטנים זיקה גבוהה, motoneurons מבטאים את הזיקה נמוך neurotrophin p75 NTR הקולטן. NTR p75 ניתן לאגד את כל neurotrophins עם זיקה דומה אך נמוך יותר מאשר לכל neurotrophins את הקולטנים זיקה גבוהה היה לאגד את neurotrophins בוגרת. בתוך חוט השדרה העוברי, NTR p75 מבוטא באופן בלעדי על ידי motoneurons השדרה 5. זה נעשה שימוש כדי לפתח טכניקות motoneuron בידוד לטהר את התאים מן הרוב המכריע של התאים סביב 6. Motoneurons בידוד בעזרת נוגדנים ספציפיים (panning) נגד דומיינים תאיים של NTR p75 יש התברר להיות שיטה יקר כמו כמות הנוגדנים משמש עבור ניסוי בודד היא גבוהה בשל גודל של צלחת המשמש פנורמי. חלופה הרבה יותר חסכוני הוא השימוש לקטינים. לקטינים הוכח באופן ספציפי להיקשר NTR p75 גם 7. השיטה הבאה מתארת טכניקה חלופית באמצעות נבט חיטה agglutinin הליך preplating במקום נוגדן p75 NTR. לקטינים מהווה חלופה זולה מאוד נוגדן p75 NTR ואת הציונים טיהור באמצעות לקטינים דומים לזה של נוגדן p75 NTR. Motoneurons מן חוט השדרה העובר יכול להיות מבודד על ידי שיטה זו, לשרוד ולצמוח מתוך neurites.
Protocol
Discussion
היתרון של טכניקה זו מבוססת לקטינים preplating היא שזה זול יותר מאשר הליך NTR מבוסס p75 פנורמי, ו לקטינים יציב יותר נוגדנים. העשרה המופיעים באיור. 2 ו Tab. 1 מראה כי הנוהל מאפשר טיהור של מספר דומה של תאים כי רוב של תאים אלה מבטאים את הסמן motoneuron איילט-1 / 2. השלב הקריטי ביותר הוא בידוד את ההליך על חוט השדרה המותני. הסרת קרומי המוח ואת DRGs (איור 2) הוא חיוני לתהליך טיהור הבאים על ידי preplating לקטינים מבוססות. אם זה כבר הצליח כראוי, כמעט כל התאים מבטאים את NTR p75 (לתמונה נציג איור. 3a). הסיבה להבדל בין הבעת איילט-1 / 2 ו – p75 NTR הוא קרוב לוודאי כי motoneurons המותני דיפרנציאלי להביע רמות גבוהים או נמוכים יותר של איילט-1 / 2 10. במקרה של רמות נמוכות של ביטוי איילט 1 / 2 זה אולי ברח תשומת הלב שלנו מכתים את immuncytochemical והספירה הבאים כפי שהיינו מחמירים ביחס תאים חיובי לעומת שלילי (Tab. 1). בנוסף, טבלה 1 מראה בבירור כי תאים מבודדים לשרוד את ההליך במצב בריא, כמו שיש רק מעטים trypan כחול התאים החיוביים מצביעים על כך התאים ניזוקו באופן בלתי הפיך. הליך זה alterative גם מאפשר בידוד של motoneurons מעוברים יחיד ולכן המלטות של גנוטיפ מעורבת מעכברים עובריים. לסיכום, זו חלופה להליך פנורמי עם הנוגדן NTR p75 יש 6 דומה אם לא זהה יכולות מבחינת טווחי יישום אפשרי מספק שיטה זולה ויעילה טיהור חלופיות motoneurons עכבר עובריים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סנדרה ברגן לקבלת תמיכה טכנית מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי מחלקת המחקר חלבון (PRD, TP A1.2 (RC ו-TS), ואת מחקר RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) נוגדנים חד שבטיים 39.4D5 ו F55A10 התקבלו ללימודי התפתחותית Hybridoma בנק (DSHB, איווה העיר, IA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | Gibco | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo | Ø 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma | L5142 | |
| Cell culture dish | Nunc | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 |
Table 3. Table of specific reagents and equipment.
References
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
