Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen
Summary
Ein alternativer Weg zur Isolierung von embryonalen Maus-Motoneurone aus dem Rückenmark beschrieben. Die Methode berücksichtigt die Tatsache, dass Lektin kann die geringe Affinität nerve growth factor receptor p75NTR binden. Das Lektin-basierte preplating ermöglicht eine Reinigung ähnlich wie mit einem spezifischen Antikörper gegen das p75NTR.
Abstract
Spinal Motoneuronen zu entwickeln in Richtung postmitotischen Etappen durch die frühe embryonale Entwicklung des Nervensystems und in der Folge wachsen Dendriten und Axone. Neuroepithelzellen des Neuralrohrs, dass ausdrückliche Nkx6.1 die einzigartige Vorläuferzellen für spinale Motoneurone 1 sind. Obwohl postmitotischen Motoneuronen auf ihre endgültige Position bewegen und organisieren sich in Spalten entlang der tractus 2,3. Mehr als 90% aller dieser differenzierten und positioniert Motoneuronen drücken die Transkriptionsfaktoren Islet 1 / 2. Sie innervieren die Muskeln der Extremitäten sowie die des Körpers und die inneren Organe. Unter anderem Motoneuronen in der Regel drücken die Rezeptoren mit hoher Affinität für Gehirn neurotrophen Faktor (BDNF) und Neurotrophin-3 (NT-3), der Tropomyosin-verwandte Kinase B und C (TrkB, TrkC). Sie drücken nicht die Tropomyosin-verwandte Kinase A (TrkA) 4. Neben den beiden Rezeptoren mit hoher Affinität, tun Motoneuronen Ausdruck der geringen Affinität Neurotrophin-Rezeptor p75 NTR. Die p75 NTR können alle Neurotrophine mit ähnlichen, aber niedriger Affinität binden alle Neurotrophine als die Rezeptoren mit hoher Affinität würde die reifen Neurotrophine binden. Innerhalb der embryonalen Rückenmark, ist die p75 NTR ausschließlich durch die spinale Motoneuronen 5 ausgedrückt. Dies wurde genutzt, um Motoneuron Isolierung Techniken zu entwickeln, um die Zellen von der überwiegenden Mehrheit der umliegenden Zellen 6 zu reinigen. Isolating Motoneuronen mit Hilfe von spezifischen Antikörpern (Panning) gegen die extrazellulären Domänen von p75 NTR hat sich ein teures Verfahren, wie die Menge des Antikörpers für ein einzelnes Experiment verwendeten hoch ist aufgrund der Größe der Platte für das Panning verwendet werden eingeschaltet. Eine viel günstigere Alternative ist die Verwendung von Lektin. Lectin hat sich gezeigt, dass sie spezifisch an p75 NTR sowie 7 zu binden. Die folgende Methode beschreibt eine alternative Technik mit Weizenkeimagglutinin für eine preplating Verfahren anstelle der p75 NTR-Antikörper. Das Lektin ist eine äußerst kostengünstige Alternative zu den p75 NTR-Antikörper und die Reinigung Sorten mit Lektin sind vergleichbar mit der des p75 NTR-Antikörper. Motoneurone aus dem embryonalen Rückenmark mit dieser Methode isoliert werden können, zu überleben und wachsen aus Neuriten.
Protocol
Discussion
Der Vorteil dieses Lektin-basierte preplating Technik ist, dass es weniger teuer als die p75 NTR-based Panning Prozedur ist, und das Lektin ist stabiler als Antikörper. Die Anreicherung in Abb. aufgeführt. 2 und Tab. 1 zeigt, dass das Verfahren erlaubt es, die Reinigung von ähnlichen Zahlen aus Zellen und dass ein Großteil dieser Zellen exprimieren das Motoneuron Marker Islet-02.01. Der wichtigste Schritt ist die Isolierung Verfahren für die Lenden-Wirbelsäule. Das Entfernen der Hirnhäute und der DRGs (Abb. 2) wird für die folgenden Reinigungsverfahren von Lektin-basierte preplating unerlässlich. Wenn dies richtig verwaltet worden, Express nahezu allen Zellen des p75 NTR (für repräsentatives Bild siehe Abb.. 3a). Der Grund für den Unterschied zwischen Ausdruck Islet-2.1-und p75 NTR ist wahrscheinlich, weil lumbalen Motoneuronen differentiell höheren und niedrigeren Ebenen des Islet-1 / 2 10 zum Ausdruck bringen. Im Falle einer niedrigen Islet-2.1 Expression könnte dies unsere Aufmerksamkeit in der immuncytochemical Färbung und anschließende Zählung entgangen sein, wie wir strengen Bezug auf positive gegen negative Zellen (Tab. 1) waren. Zusätzlich Tabelle 1 zeigt deutlich, dass die isolierten Zellen die Prozedur überleben in einem gesunden Zustand, denn es gibt nur wenige Trypan-Blau-positive Zellen, dass die Zellen irreversibel geschädigt anzuzeigen. Diese alternativen Verfahren ermöglicht auch Isolierung von Motoneuronen aus einzelnen Embryonen und daher mit gemischten Genotyp Würfe aus embryonalen Mäuse. Im Ergebnis hat diese Alternative zu den Panning Prozedur mit dem p75 NTR Antikörper 6 ähnliche, wenn nicht identisch Kapazitäten im Hinblick auf mögliche Anwendungsbereiche und bietet eine preiswerte und effiziente Alternative Reinigungsverfahren für embryonalen Motoneuronen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Sandra Bargen für einen ausgezeichneten technischen Support. Diese Arbeit wurde durch das Protein Research Department (PRD, TP A1.2 (RC und TS) und der RUB Research Fond, Rektoratsprogramme unterstützt -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Der monoklonale Antikörper 39.4D5 und F55A10 aus dem Developmental Studies Hybridoma wurden erhalten Bank (DSHB, Iowa City, IA).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide | Sigma | P8638 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | Gibco | 14170 | |
| Glass coverslips | Thermo | Ø 10 or 14mm | |
| Lectin | Sigma | L5142 | |
| Cell culture dish | Nunc | 150350 | Nunclon delta surface |
| Horse serum | Linaris | SHD3250ZK | Each batch has to be tested for MN culture |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-041 | |
| Forceps | Stainless steel, size 4 or 5 | ||
| Trypsin | Worthington | LS003707 | |
| Trypsin-Inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Anti-Islet-1 | DSHB | 39.4D5 | Cell culture supernatant |
| Anti-Nkx6.1 | DSHB | F55A10 | Cell culture supernatant |
| Anti-p75NTR | Abcam | Ab8874 |
Table 3. Table of specific reagents and equipment.
References
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
