Ambalaj HIV veya FIV tabanlı Lentivector İfade Yapıları & VSV-G Pseudotyped Viral Parçacıklarının İletimi

1. Ambalaj Plazmidler ile 293TN Hücreleri transfeksiyonu ve Expression Construct Tohum 7,0-8,0 x 10 4 mM L-glutamin, 4,5 g / l glukoz ve antibiyotikler olmadan fetal sığır serumu (% 10) ile desteklenmiş DMEM ortamı içeren kültür aracı maddesi 20 ml 15 cm 2 kültürü plakası başına 6 293TN hücreleri. Hücre yoğunluğu transfeksiyon sırasında konfluent% 60-80 ulaştığında, böylece 2 CO% 5 ile 37 ° C'de 18-24 saat boyunca büyür. Bazı durumlarda, hedef hücrelerin transdüksiyonu için yeterince yüksek bir titresi elde etmek için hücre tohumu birkaç plakaları için gerekli olabilir. Her bir hücre plakası, bir otoklav 2 ml Eppendorff tüpüne 1.6 ml serum içermeyen DMEM ekleyebilir. Lütfen lentivector 45 ul pPACKH1 veya pPACKF1 ve 4.5 mikrogram aşağı pipetleme tarafından DMEM ve karıştırın inşa ekleyin. Aynı tüpe PureFection 55 ul ekleyin. 10 saniye vorteksleyin. Oda sıcaklığında f DMEM-Plazmid-PureFection karışımı inkübeya da 15 dak. Doku kültürü plakası eşit plaka boyunca dağıtmak için hafifçe açılır bilge ve girdap DMEM-Plazmid-PureFection karışımı ekleyin. Inkübatöre çanak dönün ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de büyür. Transfeksiyondan sonra ortamı değiştirmek için gerek yoktur. Lütfen lentivector yapı GFP gibi bir floresan proteini kodlayan bir gen ifade varsa, 12-24 saat transfeksiyondan sonra mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Sen transfeksiyon başarılı olduğunu belirten,>% 90 GFP pozitif hücreler görmek gerekir. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne steril bir hücre kültürü 48 sonrası supernatant toplamak ve 72 saat. Bu, hücre kültür yüzey artık bulaşıcı pseudoviral parçacıklar içerir. Pelet oda sıcaklığında 15 dakika hücresel enkaz 1.500 xg'de (BSL-2 emniyet sınıfı ile çalışmak için önerilen yönergeleri izleyin.) Santrifüj. Pelet bozmayacak sağlayacak yeni tüp için viral süpernatant aktarın. Viral ambalaj için kullanılmış olan hücre, bir 293TN biohazard kap içinde elden ve viral ambalaj daha tur için kullanılmak üzere değildir edilmelidir. 2. Viral Süpernatant konsantrasyonu 1 soğuk hacmi (4 ° C) lentiviral parçacık içeren süpernatant her 4 cilt için PEG-it Virüs Yağış Çözüm. Ekle Büyük miktarlar lentiviral parçacıkların Çökelti Corning 250 ml polipropilen santrifüj tüpü ile elde edilebilir. Ters tüpler tarafından bir kaç kez çözeltisi karıştırın, fakat karışımı vorteks yoktur. (4 güne kadar kabul edilebilir), en azından 12 saat boyunca 4 ° C sıcaklıkta çözelti soğutmak. Sallamayın veya soğutma adım sırasında tüpleri döndürmeyin. 4 de 30 dakika boyunca 1500 x g'de süpernatan / PEG-it karışımı santrifüje ° C. Santrifüjünden sonra lentiviral parçacıklar tüp alt kısmında bir bej veya beyaz bir pelet şeklinde görünür. Supernata dökmeknt. Pelet içinde çöken lentiviral parçacıklar rahatsız özen, aspirasyon sıvısı tüm izlerini silmek. Izleri kalıntı PEG-it virüsü seyreltik edecek (böylece titresi azaltarak) fakat PEG-etkisiz ve toksik olmayan yana hedef hücrelerin bütünlüğü etkilemez. Yeniden süspanse ve (4 ° C) kullanılarak soğuk orijinal hacminin 1/100 içinde lentiviral parçacıklar birleştirmek, steril fosfat tamponlu salin ya da DMEM 25 mM HEPES tampon içeren. Kullanıma hazır olana kadar steril kriyojenik flakon ve -70 ° C mağaza içine tablet. 3. Hedef Hücre Viral Titering ve İletimi Biz hedef hücrelerin-of-ilgi transducing ve deneyler arasında tutarlılık için hedef hücreler için enfeksiyon uygun çokluğu (İçişleri Bakanlığı) hesaplamadan önce lentiviral parçacıklar titering öneririz. Viral titering için, bir kolay enfekte pozitif kontrol hattı olarak HT1080 hücreleri kullanmanızı öneririz. Pltitering protokolü paketledim lentiviral parçacıkların küçük bir kısım ile HT1080 hücreleri transducing içerdiğini unutmayın kolaylığı. Titresi bilinmektedir sonra, hedef hücreler-of-ilgi de üretilen lentiviral partikülleri ile transdük edilebilir. : Bir tavsiye titering protokol bulunabilir http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. Hücre kültür ortamına bir 24-iyi plaka iyi başına Plaka 50.000 hedef hücrelerin-of-faiz. Hücreler normalde belirtilen kültür koşullarında in kültüre hücrelerin gecede büyümek olduğunu ortamları kullanın. Hücreler transdüksiyon gününde konfluent% 50 ile 70 arasında olmalıdır. Transdüksiyon gününde, hücrelerden medya aspire. Bir 1 x nihai konsantrasyon (örneğin, 2.5 ul TransDux üzere 500 ul kültür ortamı) ile TransDux ile kültür ortamı birleştirir. Sonra TransDux-ce aktarmakher oyuğa ll kültür ortamı karışımı. Her oyuğuna hedef hücreler için MOI optimum tekabül virüsünün uygun hacimde Pipeti. Optimum MOI bilinmiyorsa, farklı Mois bir dizi (örneğin, bir MOI 1, 2 ve 5 doku kültür hücre kolay-enfekte için, ve bir MOI daha zor-etmek için 1, 10 ve 20 olarak çalışan önermektedir ) birincil hücreleri enfekte. Lentiviral parçacıkların konsantrasyonu (gibi bir virüs titering protokolü ile belirlenir) bilinmiyorsa, virüsün farklı birimleri gibi virüs 1, 2 ve 5 ul olarak, denenebilir. Virüs 72 saate kadar için hedef hücreler ile temas halinde kalabilmektedir. Ile daha da deneyler hedef hücreler-of-ilgi transdük viral yapı konak hücrenin genomu içine entegre sonra, transdüksiyon 72 saat sonra başlatılabilir. Kendi özel ihtiyaçlarına göre hücre-of-ilgi orta ve geçit hedef değiştirin. 4. Temsilcisi Sonuçlar <p293TN hücrelerin class = "jove_step"> Transfeksiyon 293TN hücrelerin başlangıç ​​yoğunluğu başarılı viral ambalaj için önemlidir. 293TN hücrelerinin transfeksiyonu gün (Şekil 2)% 60 -80 arasındaki konfluent olmalıdır. 293TN hücrelerin% 60 konfluent daha az varsa, onları transfeksiyon başlamadan önce bir kaç saat daha büyümeye olanak sağlar. 293TN hücreleri>% 80 konfluent olduklarında, transfeksiyondan önce kaplandı edilmelidir. Bir lentivector ifade GFP kullanılıyorsa, 293TN hücrelerin en az% 90, başarılı bir transfeksiyon (Şekil 3) gösteren, transfeksiyondan 24 saat sonra, yeşil floresan gerekir. Hücrelerin% 90'ından daha az GFP-olumlu ise, bu transfeksiyon olabilecek şekilde başarılı olmadığı gösterir, ve viral titreleri düşük olacaktır, çünkü, sonraki adıma değildir. Bunun yerine, plaka yeni 293TN hücreleri ve transfekte önce 293TN hücrelerin uygun hücre yoğunluğu az olduğundan emin olarak, baştan başlamak. 293TN hücreleri 48-72 saat transfeksiyondan sonra doku kültürü plakaları çekip olabilir. Bu olumsuz lentiviral partiküllerin üretimi etkilemez. HT1080 Hücreleri ile Titering Viral titreleri üreticinin talimatlarına göre SBI Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti kullanılarak hesaplanabilir. Bu sistem, hücreleri içine HT1080 lentiviral vektöründen WPRE sekansının viral entegrasyonu ölçmek için qPCR kullanmaktadır ve doğru bir ml için enfeksiyöz birimi (Şekil 4) ölçmek için bir genomik dizisi referans dayanan, bir standart eğri ile kıyaslar. Hedef Hücre İletimi Bir yapısal olarak aktif GFP işaretleyici ifade lentiviral parçacıklar kullanıyorsanız transdüksiyon reaksiyon çalışıyorsa, GFP pozitif hücrelerin, iletimi 12-24 saat içinde görünmeye başlayacaktır. Lentiviral yapı stabil t entegre sonra GFP devam etmeliO hücre genomu ev sahipliği yapacak. Farklı Mois ile transducing ise, GFP floresans yaklaşık İçişleri Bakanlığı, düşük Mois GFP floresans (Şekil 5) artış gösterirler az GFP floresans ve yüksek Mois gösterin eşleşmesi gerekir. Şekil 1. Viral üretim protokol bakış. Lentivector ve pPACK ambalaj plazmidler karıştırılır ve 293TN hücrelerine birlikte transfekte edilir. 48 -72 saat sonra, süpernatan viral toplanır, ve viral partiküllerin PEG-it ile çökeltilir. Lentiviral parçacıklar titering sonra, hücre-of-faiz hedef transdüksiyonu için kullanılabilir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . 293TN hücrelerinin Şekil 2. Faz kontrastlı görüntü. Hücre Density% 60-80 konfluent transfeksiyon gününde arasında olmalıdır. Şekil 3. 24 saat Purefection, pPACKH1, ve bir kodlama GFP lentivector yapı ile transfeksiyondan sonra GFP-pozitif hücrelerinin 293TN Fluorescent görüntüsü. Şekil 4. WPRE qPCR sonuçlar ve İçişleri Bakanlığı ve ambalajlı viral parçacıkların ilgili titresi hesaplamak için SBI Küresel ultrahızlı bireylerde Titering kiti kullanılarak elde edilen standart eğri. HT1080 hücre Şekil 5. Floresan görüntüleri lentivirüs artan miktarlarda ile transdük. Görüntüler 72 saat sonrası transdüksiyon gelmektedir.