אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

1. Transfection של תאים 293TN עם פלסמידים אריזה והביטוי לבנות זרע 7.0-8.0 x 10 6 תאים 293TN בכל צלחת 2 15 תרבות ס"מ 20 מ"ל של מדיום תרבות המכיל בינוני DMEM השלימו עם 4 מ"מ L-גלוטמין, 4.5 גר '/ ליטר גלוקוז בדם העובר שור (10%) ללא אנטיביוטיקה. לגדול במשך 18-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם CO 5% 2, כך צפיפות התאים מגיע ל 60-80% confluency בזמן transfection. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך צלחות זרעים שונים של תאים להשיג titer גבוהה מספיק עבור התמרה של תאים היעד. על כל צלחת של תאים, להוסיף 1.6 מ"ל סרום ללא DMEM כדי צינור autoclaved 2 Eppendorff מ"ל. הוסף 45 μl pPACKH1 מיקרוגרם או pPACKF1 ו -4.5 של lentivector שלך כדי לבנות DMEM ומערבבים ידי pipetting מעלה ומטה. הוסף 55 μl של PureFection לתוך צינור אחד. מערבולת למשך 10 שניות. דגירה את התערובת-פלסמיד-PureFection DMEM ב F בטמפרטורת החדראו 15 דקות. מוסיפים את תערובת-פלסמיד-PureFection DMEM לצלחת רקמת התרבות נפתח חכם מערבולת בעדינות כדי לפזר באופן שווה לאורך כל הצלחת. להחזיר את התבשיל כדי חממה לגדול ב 37 ° C עם 5% CO 2. אין צורך לשנות את התקשורת לאחר transfection. אם מבנה lentivector שלך מבטא את הגן המקודד חלבון פלואורסצנטי כמו ה-GFP, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ 12-24 שעות לאחר transfection. אתה אמור להיות מסוגל לראות> תאים 90% GFP חיובי, המעיד על כך transfection הצליחה. איסוף תרבית תאים supernatant לאחר 48 ו – 72 שעות אל תוך צינור 50 צנטריפוגות סטרילית מ"ל. זה supernatant תרבית תאים כעת מכיל חלקיקים pseudoviral זיהומיות. (פעל על פי ההנחיות המומלצות לעבודה עם דרגת הגנה BSL-2.) צנטריפוגה XG ב 1500 במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה פסולת הסלולר. העברת supernatant ויראלי צינור חדש, על מנת להבטיח שלא להפריע גלולה. תאים 293TN שנוצלו על האריזה ויראלי צריך להיות מסולק במיכל Biohazard ואינם לשמש סבב נוסף של אריזות ויראלי. 2. ריכוז Supernatant ויראלי הוסף 1 נפח קר (4 מעלות צלזיוס) PEG-IT רטיבות וירוס פתרון כל 4 כרכים של supernatant חלקיק המכיל lentiviral. משקעים של חלקיקים lentiviral של כמויות גדולות ניתן להשיג עם קורנינג 250 מ"ל צנטריפוגות צינורות פוליפרופילן. מערבבים את הפתרון על ידי פעמים צינורות היפוך מספר, אבל אל מערבולת את התערובת. מקררים את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 12 שעות (עד 4 ימים מקובל). לא ללחוץ או לסובב את הצינורות במהלך שלב הקירור. בצנטריפוגה תערובת supernatant / PEG-IT ב 1500 XG במשך 30 דקות 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, חלקיקים lentiviral יופיע בצבע בז' או לבן גלולה בחלק התחתון של הצינור. יוצקים את supernataNT. הסר את כל עקבות של נוזלים על ידי שאיפה, נזהרת שלא להפריע את חלקיקי lentiviral שזירזו ב גלולה. עקבות של שיורי-PEG יהיה לדלל את הנגיף (ובכך להקטין את titer), אך לא ישפיע על שלמות התאים היעד מאז PEG-IT הוא אינרטי ולא רעיל. Resuspend ולשלב את חלקיקי lentiviral ב 1/100 של נפח המקורי באמצעות קר (4 מעלות צלזיוס), פוספט סטרילית שנאגרו מלוחים או DMEM המכיל 25 HEPES חוצץ מ"מ. Aliquot לתוך צלוחיות קריוגני סטריליים החנויות ב -70 ° C עד מוכן לשימוש. 3. Titering פרידמן וקיבל הד עולמי ויראלי של תאים היעד אנו ממליצים titering חלקיקים lentiviral לפני transducing היעד תאים של ריבית וחישוב ריבוי הולם של זיהום (משרד הפנים) על התאים היעד עבור עקביות בין הניסויים. עבור titering ויראלי, מומלץ להשתמש HT1080 תאים כקו קל להדביק חיובית שליטה. Plלהקל לציין כי פרוטוקול titering כרוך transducing HT1080 תאים עם aliquot קטן של חלקיקים lentiviral לך ארוזים. לאחר titer ידוע, היעד תאים של ריבית ניתן transduced עם חלקיקים lentiviral המיוצרים. פרוטוקול ממליצים titering ניתן למצוא בכתובת: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. 50,000 פלייט היעד תאים של ריבית לכל גם בצלחת 24 גם בתקשורת תרבית תאים. השתמש בתקשורת כי תאים בתרבית בדרך כלל פנימה לגדול בתאים לילה בתנאים שצוינו תרבותם. תאים צריכים להיות בין 50 עד 70% confluent ביום התמרה. ביום של התמרה, לשאוב את התקשורת מן התאים. שלב בינוני תרבות עם TransDux לריכוז x 1 הסופי (לדוגמה, 2.5 TransDux μl עד 500 μl של המדיום תרבות). לאחר מכן להעביר את TransDux-CE תרבות LL בינוני התערובת היטב כל אחד מהם. פיפטה בנפח מתאים של וירוס אשר תואמים את האופטימלי עבור משרד הפנים את התאים לתוך היעד גם כל אחד. אם משרד הפנים האופטימלי אינו ידוע, מומלץ לנסות את מגוון MOIs שונים (כגון משרד הפנים של 1, 2 ו – 5 עבור קל להדביק התרבות תאים ורקמות, ועל משרד הפנים של 1, 10 ו 20 יותר קשות , להדביק תאים ראשוניים). אם ריכוז של חלקיקים lentiviral לא ידוע (כפי שנקבע באמצעות פרוטוקול titering וירוס), כמויות שונות של הנגיף יכול להישפט, כגון μl 1, 2 ו – 5 של הנגיף. הווירוס יכול להישאר בקשר עם התאים היעד של עד 72 שעות. ניסויים נוספים עם transduced תאים של ריבית היעד רשאי להגיש 72 שעות לאחר התמרה, פעם מבנה ויראלי שילבה לתוך הגנום של התא המארח. שנה בינונית מעבר היעד תאים של ריבית על פי הצרכים הספציפיים שלהם. 4. נציג תוצאות <p = "jove_step" המעמד> transfection של תאים 293TN צפיפות המוצא של התאים 293TN הוא קריטי עבור אריזה ויראלי מוצלח. תאים 293TN חייב להיות בין 60% -80 confluent יום transfection (איור 2). אם התאים 293TN פחות מ confluent 60%, לאפשר להם לגדול במשך עוד כמה שעות לפני שתנסה transfection. אם התאים הם 293TN> confluent 80%, הם צריכים להיות replated לפני transfection. אם באמצעות ה-GFP להביע lentivector, לפחות 90% מהתאים 293TN צריך לזרוח ירוקים 24 שעות לאחר transfection, המציין transfection מוצלחת (איור 3). אם פחות מ 90% מכלל התאים GFP חיובי, לא להמשיך לשלב הבא, כי זה מצביע על כך transfection לא היה מוצלח, ואת titers ויראלי יהיה נמוך. במקום זאת, תאים חדשים צלחת 293TN ולהתחיל מחדש, כדי לוודא שהתאים 293TN הם בצפיפות תאים תקינה לפני transfecting. תאים 293TN יכול לשלוף את תרבות צלחות רקמות 48-72 שעות לאחר transfection. זה לא להשפיע לרעה על ייצור של חלקיקים lentiviral. Titering עם HT1080 תאים Titers ויראלי יכול להיות מחושב באמצעות ערכת Titering UltraRapid גלובלי של SBI על פי הוראות היצרן. מערכת זו עושה שימוש QPCR למדוד ויראלי שילוב של רצף wpre מ וקטור lentiviral אל HT1080 תאים ומשווה את זה עקום רגיל, המבוסס על רצף הגנום התייחסות כדי למדוד במדויק את יחידות זיהומיות לכל מ"ל (איור 4). התמרה של תאים היעד אם אתה משתמש חלקיקים lentiviral המבטאים סמן GFP פעיל constitutively, תאים GFP חיוביים צריך להתחיל להופיע בתוך 12-24 שעות של התמרה, אם התגובה התמרה עובד. ביטוי של GFP יש להמשיך אחרי מבנה lentiviral ביציבות משתלב לאהוא לארח בגנום התא. אם transducing עם MOIs שונים, הקרינה GFP יש כ להתאים את משרד הפנים, שם MOIs נמוכות להראות הקרינה GFP פחות MOIs גבוהות יותר להראות עלייה GFP הקרינה (איור 5). באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול ייצור ויראלי. פלסמידים את האריזה lentivector ו pPACK מעורבות ושיתוף transfected לתאי 293TN. לאחר 48 -72 שעות, supernatant ויראלי נאסף, ואת חלקיקים נגיפיים הם זירז עם PEG-IT. לאחר titering חלקיקים lentiviral, הם יכולים לשמש transduce היעד תאים של ריבית. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה . 2. איור שלב לעומת זאת התמונה של תאים 293TN. תא densitY צריך להיות בין 60-80% confluent יום transfection. איור 3. תמונת הניאון של תאים GFP חיובי 293TN 24 שעות לאחר transfection עם Purefection, pPACKH1, ו-GFP קידוד lentivector לבנות. איור 4. תוצאות wpre QPCR ואת עקומת סטנדרט להשיג באמצעות ערכת Titering UltraRapid גלובלי של SBI לחשב משרד הפנים ו titer המקביל חלקיקים נגיפיים ארוזים. איור 5. תמונות של פלורסנט HT1080 תאים transduced עם כמויות הולכות וגדלות של lentivirus. התמונות הן מ 72 שעות לאחר התמרה.