Лентивирусов векторов экспрессии является наиболее эффективным средством стабильно, выражающих различные эффекторные молекулы или репортер конструкций в разделении и без деления клеток млекопитающих и целые организмы. Здесь мы предоставляем протокол о том, как упаковать lentivector конструкций выражение в pseudoviral частиц и преобразовывать клетки-мишени использованием pseudoviral частиц.
As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7.
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter.
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein.
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.
Это вирусное упаковки и трансдукции протокол клетки-мишени был оптимизирован для использования с вирусными реагентов ВОО на упаковке. Замена других реагентов может повлиять на исход протокола. Этот протокол был только оптимизирован для лентивирусов производства и не могут быть пригодны для производства других типов вирусов или pseudoviruses.
Успешные вирусные упаковки зависит от нескольких ключевых этапов. 293TN клетки экспрессируют SV40 большой Т-антиген, который является абсолютно необходимым для секреции лентивирусов частиц в супернатант культуры клеток. Плотность, при которой 293TN клетки во время трансфекции особенно важно для того, чтобы PureFection реагента достаточно передать lentivector и упаковка плазмиды в клетки. Добавление PureFection смесь на плиту культуры тканей в каплям образом следует тщательно закрученной пластины важно для разгона упаковке плазмидыlentivector и построить по всей клетки. Отсутствие надлежащего распространения векторов может привести к недостаточной лентивирусов частиц производится. Вирусной реакции упаковки могут быть расширены для производства высококачественных титра вируса, основанный на поверхность пластины тканевой культуры. Можно выбрать несколько пластин культуры тканей блюда 293TN клеток на конструкцию, которая должна быть упакована. Концентрация вирусной супернатантах особенно полезно при создании высоким титром вируса. Вирусный супернатант из нескольких пластин клетки могут быть объединены и сконцентрированы для использования в в естественных условиях эксперименты, или клетки, которые являются трудными для трансдукции.
Titering производится лентивирусов частиц важна для расчета точной МВД использовать для трансдукции клеток-мишеней. Зная, МВД, которая была использована в данном трансдукции позволяет устранения в том случае, трансдукция не увенчались успехом. Например, с помощью МВД, которыйслишком низком уровне может привести к очень мало клеток-мишеней выражает конструкция, из интереса. Использование МВД, что слишком высокая, однако, может привести к клеткам-мишеням, которые показывают признаки стресса. Цель заключается в использовании МВД, которая максимизирует выражение конструкция интересов, сохраняя здоровье клеток. Хотя мы рекомендуем КПЦР основе titering протокол, который измеряет интегрированных копий лентивирусов конструкцию в HT1080 клеток, другие подходы titering также может быть использован, например, p24 ELISA или оценка процентов GFP-положительных клеток.
Успешное трансдукции клеток-мишеней зависит также и от нескольких ключевых факторов. TransDux уникальный реагент инфекция, которая позволяет с высокой эффективностью трансдукции, но это не токсичен для клеток. TransDux могут быть использованы вместо polybrene, который часто токсичны для клеток-мишеней. Включение TransDux в трансдукции клеток-мишеней помогает нейтрализовать заряды на вирусные частицы и позволяет вируса в клеткус. С TransDux не токсичен для клеток, можно позволить лентивирусов частицы остаются в контакте с клетками в течение 72 часов (время, когда вирусные конструкции были интегрированы в геном клетки-хозяина), тем самым увеличивая вероятность того, что вирусных частиц, поступающих в клетку. Для некоторых трудных для трансдукции клеток, трансдукции может быть повторена в последующие дни, чтобы повысить эффективность трансдукции. Например, трансдукции клеток в 1 день, позволяют клеткам отдохнуть на 2-й день, а затем преобразовывать клетки снова на 3-й день. Важно, чтобы ждать 72 часов после последнего трансдукции перед началом отбора, дальнейшие эксперименты или характеристик клеток-мишеней.
Эффективность вирусной упаковке зависит также от размера лентивирусов конструкция, между 5 и 3'LTR регионах. В этом разделе лентивирусов конструкция должна быть около 9 кб или меньше, что соответствует размеру родной генома ВИЧ. Превышение 9 кб может де-увеличение титра производится pseudoviral частиц. Новые технологии, такие как piggyBac векторов транспозонов, позволяют надежной, стабильной интеграции трансгенов до 100 кб через один трансфекции. Такой подход может быть использован для конструкций, которые превышают предельный размер для лентивирусов векторов, в тех случаях, где это возможно для трансфекции клеток-мишеней, а также предоставляет дополнительное преимущество, не требующие вирусных шаг упаковке 9,10.
Pseudoviral частиц, полученные с использованием этого протокола являются инфекционными, что они могут заразить большинство типов клеток млекопитающих. Продукты, используемые в настоящем протоколе, однако это третье поколение biosafe в том, что они производят, не репликативной и самостоятельно инактивируют pseudoviruses. Поэтому, как только преобразуются в клетки-мишени или животных, клетки-мишени или животных, не инфекционной или заразной. Замена других lentivector плазмиды, которые не являются третьего поколения biosafe возможно, хотя и не рекомендуется с биобезопасностьюперспективу. Вирусной Протокол производства и последующей трансдукции клеток-мишеней должно осуществляться под 2-го уровня биобезопасности, в соответствии с руководящими принципами NIH 11, и исследователи должны всегда носить халат и перчатки при работе с вирусными частицами. Используется 293TN клеток производителя труб вирусных частиц, а также одноразовые пипетки следует выбрасывать в контейнер для биологически опасных соответствующий. Многоразовые пипетки и посуда должны быть обеззаражены с отбеливателем и автоклавирования для уменьшения облучения персонала.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы выразить признательность сотрудникам и ученые ВОО за их поддержку в разработке и тестировании этих протоколов.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11995-073 | |
293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
PureFection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 |
|
PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 |
|
Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
TransDux | SBI | LV850A-1 |