Emballage VIH ou FIV à base de constructions d'expression et de transduction du Lentivector VSV-G pseudotypés particules virales

1. La transfection de cellules avec des plasmides 293TN emballage et la construction d'expression Graine de 7,0 à 8,0 x 10 6 cellules par 15 293TN plaque de culture cm 2 dans 20 ml de milieu de culture contenant du milieu DMEM additionné de 4 mM de L-glutamine, 4,5 g / l de glucose, et sérum de veau fœtal (10%) sans antibiotiques. Cultiver pendant 18-24 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2 de sorte que la densité cellulaire atteint 60-80% de confluence au moment de la transfection. Dans certains cas, il peut être nécessaire à des plaques de semences de plusieurs cellules pour obtenir un titre suffisamment élevé pour que la transduction des cellules cibles. Pour chaque plaque de cellules, ajouter 1,6 ml DMEM sans sérum dans un tube stérilisé à l'autoclave 2 ml Eppendorff. Ajouter 45 ul pPACKH1 ou pPACKF1 et 4,5 mg de votre lentivector construire à l'DMEM et mélanger par pipetage de haut en bas. Ajouter 55 ul de PureFection dans le même tube. Vortex pendant 10 secondes. Incuber le milieu DMEM-plasmide-PureFection mélange à température ambiante fou 15 min. Ajouter le DMEM-plasmide-PureFection mélange sur la plaque de culture de tissus goutte à goutte et agiter doucement pour disperser uniformément tout au long de la plaque. Retour le plat dans l'incubateur et de croître à 37 ° C avec 5% de CO 2. Il n'est pas nécessaire de changer les médias après la transfection. Si votre lentivector construction exprime un gène codant pour une protéine fluorescente comme la GFP, vérifiez vos cellules sous un microscope 12-24 heures après la transfection. Vous devriez être capable de voir les cellules> 90% GFP-positives, indiquant que la transfection a été un succès. Recueillir le surnageant de culture cellulaire après 48 et 72 heures dans un tube de centrifugation de 50 ml stérile. Ce surnageant de culture cellulaire contient maintenant les particules infectieuses pseudoviral. (Suivez les lignes directrices recommandées pour travailler avec la classe de protection BSL-2). Centrifuger à 1500 xg pendant 15 min à température ambiante pour obtenir un culot les débris cellulaires. Transférer le surnageant viral dans un nouveau tube, en veillant à ne pas perturber le culot. Cellules 293TN qui ont été utilisés pour les emballages virale doivent être éliminés dans un container prévu à et ne doivent pas être utilisés pour d'autres séries d'emballages virale. 2. Concentration du surnageant viral Ajouter 1 volume de froid (4 ° C) PEG-il Precipitation Solution Virus tous les 4 volumes de lentiviral contenant des particules surnageant. Précipitation de particules de lentiviraux de gros volumes peut être réalisé avec des tubes de 250 ml Corning centrifugeuses en polypropylène. Mélanger la solution par les temps les tubes retournant plusieurs, mais ne pas vortexer le mélange. Réfrigérer la solution à 4 ° C pendant au moins 12 heures (jusqu'à 4 jours est acceptable). Ne pas secouer ou faire pivoter les tubes lors de l'étape de réfrigération. Centrifuger le surnageant / PEG-il mélange à 1500 xg pendant 30 minutes à 4 ° C. Après centrifugation, les particules lentiviraux apparaît comme une pastille ou beige au fond du tube. Verser le supernatant. Retirer toutes les traces de liquide par aspiration, en prenant soin de ne pas déranger les particules précipitées lentiviraux dans le culot. Des traces de résidus de PEG-il diluer le virus (réduisant ainsi le titre), mais ne sera pas atteinte à l'intégrité des cellules cibles depuis le PEG-il est inerte et non toxique. Remettre en suspension et mélanger les particules en lentiviraux 1/100 du volume d'origine en utilisant le froid (4 ° C), le phosphate de stérile ou une solution saline tamponnée DMEM contenant 25 mM de tampon HEPES. Aliquoter dans stériles fioles cryogéniques et conserver à -70 ° C jusqu'à ce que prêt à l'emploi. 3. Titrage virale et la transduction des cellules cibles Nous recommandons titrage des particules lentiviraux avant transduction la cible des cellules d'intérêt et le calcul de la multiplicité approprié d'infection (MOI) pour les cellules cibles pour la cohérence entre les expériences. Pour titrage viral, nous vous recommandons d'utiliser des cellules HT1080 comme une ligne de commande facile à infecter positif. Plla facilité noter que le protocole titrage implique la transduction des cellules HT1080 avec une petite aliquote des particules lentiviraux vous avez emballés. Une fois que le titre est connu, les cellules cibles d'intérêt peut également être transduites avec les particules produites lentiviraux. Un protocole titrage recommandons peut être trouvé à: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. Plaque de mire 50.000 cellules d'intérêt par puits dans une plaque de 24 puits dans les milieux de culture de cellules. Utiliser les médias que les cellules sont normalement cultivées in cultiver les cellules pendant la nuit à leurs conditions de culture spécifiques. Cellules doit être compris entre 50 à 70% confluente le jour de la transduction. Le jour de la transduction, aspirer les médias à partir des cellules. Combinez milieu de culture avec TransDux à une concentration x 1 finale (par exemple, 2,5 TransDux ul à 500 ul de milieu de culture). Puis transférer le TransDux-CEll mélange milieu de culture dans chaque puits. Introduire à la pipette le volume approprié de virus qui correspond à la MOI optimale pour les cellules cibles dans chaque puits. Si la MOI optimale est inconnue, nous vous recommandons d'essayer toute une gamme de différents IAM (comme une MOI de 1, 2 et 5 pour facile à infecter les cellules de culture de tissus, et une MOI de 1, 10 et 20 pour plus difficile à -infecter les cellules primaires). Si la concentration des particules lentiviraux n'est pas connu (tel que déterminé par un protocole titrage du virus), des volumes différents de virus peut être essayé, tels que pi 1, 2 et 5 du virus. Le virus peut rester en contact avec les cellules cibles pour un maximum de 72 heures. D'autres expériences avec les cellules transduites d'intérêt cibles ne peut être intentée 72 heures après la transduction, une fois la construction virale a intégré dans le génome de la cellule hôte. Changer le support et le passage de la cible les cellules d'intérêt en fonction de leurs besoins spécifiques. 4. Les résultats représentatifs <pclass = "jove_step"> La transfection de cellules 293TN La densité de départ des cellules 293TN est critique pour l'emballage virale réussie. 293TN cellules doit être comprise entre 60 -80% de confluence du jour de transfection (figure 2). Si les cellules sont 293TN moins de 60% de confluence, leur permettre de croître pendant quelques heures plus avant de tenter la transfection. Si les cellules sont confluentes 293TN> 80%, ils devraient être réétalées avant la transfection. Si en utilisant une GFP lentivector exprimant, au moins 90% des cellules 293TN doit fluorescence verte 24 heures après la transfection, indiquant une transfection avec succès (figure 3). Si moins de 90% des cellules sont GFP-positives, ne pas procéder à l'étape suivante, car cela indique que la transfection n'a pas réussi, et les titres viraux sera faible. Au lieu de cela, la plaque de nouvelles cellules 293TN et recommencer, faire en sorte que les cellules 293TN sont à la densité cellulaire appropriée, avant la transfection. Cellules 293TN peut retirer les plaques de culture tissulaire 48-72 heures après la transfection. Cela ne veut pas nuire à la production de particules lentiviraux. Titrage avec des cellules HT1080 Les titres viraux peuvent être calculés à l'aide du kit de SBI mondial Titrage ultrarapide selon les instructions du fabricant. Ce système utilise qPCR pour mesurer l'intégration de la séquence virale WPRE à partir du vecteur lentiviral dans des cellules HT1080 et la compare à une courbe standard, basé sur une séquence de référence pour mesurer avec précision génomique unités infectieuses par ml (Figure 4). La transduction des cellules cibles Si vous utilisez des particules lentiviraux exprimant un marqueur GFP constitutivement active, les cellules GFP-positives devraient commencer à apparaître dans les 12-24 heures de la transduction, si la réaction est la transduction de travail. Expression de la GFP devrait se poursuivre après la construction lentiviral intègre de manière stable dans til accueillera génome de la cellule. Si transduction avec IAM différentes, la fluorescence GFP devrait approximativement correspondre à la MOI, MOI, où de faibles montrent une fluorescence GFP et moins élevés IAM présentent une augmentation de fluorescence de la GFP (figure 5). Figure 1. Vue d'ensemble du protocole de production virale. Les plasmides d'emballage et de lentivector PPACK sont mélangés et co-transfectés dans des cellules 293TN. Après 48 -72 heures, le surnageant est recueilli virale, et les particules virales sont précipités avec du PEG-ci. Après titrage des particules lentiviraux, ils peuvent être utilisés pour transduire des cellules de la cible d'intérêt. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. L'image en contraste de phase de cellules 293TN. Densit portabley doit être comprise entre 60-80% de confluence le jour de la transfection. Figure 3. L'image fluorescente des cellules GFP-positives 293TN 24 heures après transfection avec Purefection, pPACKH1, et une construction codant pour la GFP lentivector. Figure 4. Résultats de qPCR WPRE et la courbe standard obtenue à l'aide du kit de SBI mondial Titrage ultrarapide pour calculer MOI et le titre correspondant de emballés particules virales. Figure 5 images. Fluorescentes de cellules HT1080 transduites avec des quantités croissantes de lentivirus. Les images sont de 72 heures après transduction.