Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

1. Transfektion von Zellen mit 293TN Packaging Plasmide und das Expressionskonstrukt Samen von 7,0 bis 8,0 x 10 6 Zellen pro 293TN 15 cm 2 Kulturplatte in 20 ml Kulturmedium, das DMEM-Medium mit 4 mM L-Glutamin, 4,5 g / l Glucose und fötales Rinderserum (10%) ohne Antibiotika ergänzt. Wachsen für 18-24 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2, so dass die Zelldichte 60-80% Konfluenz erreicht zum Zeitpunkt der Transfektion. In einigen Fällen kann es notwendig sein, mehrere Platten Saatgut von Zellen, um eine ausreichend hohe Titer für die Transduktion von Zielzellen zu erhalten. Für jede Platte von Zellen, fügen 1,6 ml serumfreiem DMEM einer autoklavierten 2 ml Eppendorff Rohr. In 45 ul pPACKH1 oder pPACKF1 und 4,5 ug Ihre lentivector zu konstruieren, um die DMEM zugeben und durch Auf-und Abpipettieren. In 55 ul PureFection in das gleiche Rohr. Vortex für 10 Sekunden. Inkubieren Sie die DMEM-Plasmid-PureFection Mischung bei Raumtemperatur foder 15 min. Fügen Sie das DMEM-Plasmid-Mischung auf die PureFection Gewebekulturplatte tropfenweise und behutsam schwenken, um gleichmäßig über die Platte zu verteilen. Senden Sie das Gericht in den Inkubator und wachsen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Es besteht keine Notwendigkeit, die Medien nach der Transfektion zu ändern. Wenn Ihr lentivector Konstrukt drückt ein Gen für ein fluoreszierendes Protein wie GFP, überprüfen Sie Ihre Zellen unter einem Mikroskop 12-24 Stunden nach der Transfektion. Sie sollten in der Lage,> 90% GFP-positive Zellen zu sehen, was darauf hinweist, dass die Transfektion erfolgreich war. Sammeln der Zellkulturüberstand nach 48 und 72 Stunden in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen. Dieser Zellkulturüberstand enthält nun infektiöse Partikel pseudoviral. (Befolgen Sie die empfohlenen Richtlinien für die Arbeit mit BSL-2 Schutzklasse.) Zentrifuge bei 1.500 xg für 15 min bei Raumtemperatur zu Pellet die Zelltrümmer. Übertragen der viralen Überstand in ein neues Röhrchen, so dass nicht zu stören, um das Pellet. 293TN Zellen, die für virale Verpackung verwendet wurden sollten in die dafür Behälters angeordnet sein und sind nicht für weitere Runden der viralen Verpackung verwendet werden. 2. Die Konzentration der viralen Überstand Fügen Sie ein Volumen von kaltem (4 ° C) PEG-it Virus Niederschlag Lösung aller 4 Bände von lentiviralen Partikel enthaltenden Überstand. Niederschlag von lentiviralen Partikel aus großen Volumina können mit Corning 250 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen erreicht werden. Mischen Sie die Lösung durch Umdrehen der Röhrchen mehrere Male, aber nicht vortexen die Mischung. Kühlschrank der Lösung bei 4 ° C für mindestens 12 Stunden (bis zu 4 Tage sind möglich). Nicht schütteln oder drehen die Rohre während der Kälte-Schritt. Zentrifugieren der Überstand / PEG-Mischung ist bei 1.500 × g für 30 Minuten bei 4 ° C Nach der Zentrifugation werden die lentivirale Partikel als beige oder weiß Pellet am Boden des Röhrchens zu sehen. Gießen Sie das supernatant. Entfernen Sie alle Spuren von Flüssigkeit durch Absaugen, dabei nicht um die abgeschiedenen Lentivirale Partikel im Pellet zu stören. Spuren von restlichen PEG-wird das Virus verdünnen (wodurch die Titer) aber keinen Einfluss auf die Integrität der Zielzellen, da es PEG-inert ist und nicht toxisch. Resuspendieren und kombinieren Sie die lentiviralen Partikeln in 1/100 des ursprünglichen Volumens mit kaltem (4 ° C), steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder DMEM mit 25 mM HEPES-Puffer. Aliquotieren in sterile Kryoröhrchen und bei -70 ° C bis zur Verwendung. 3. Virale Titrierung und Transduktion von Zielzellen Wir empfehlen die Titrierung Lentivirale Partikel vor Transduktion der Zielzellen-of-Interest und die Berechnung des jeweiligen Multiplizität der Infektion (MOI) für die Zielzellen für Kohärenz zwischen den Experimenten. Für virale Titerung, empfehlen wir die Verwendung HT1080-Zellen als einfach zu infizieren positive Steuerleitung. PlErleichterung fest, dass die Titrierung Protokoll transduzierenden HT1080-Zellen mit einem kleinen Aliquot der Lentivirale Partikel verpackt haben Sie sich bringt. Wenn der Titer bekannt ist, können die Zielzellen-von-Interesse auch mit den lentiviralen hergestellt Teilchen transduziert werden. : A empfehlen Titerung Protokoll finden Sie unter http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. Tafel 50.000 Zielzellen-von-Interesse-pro Well in einer 24-Well-Platte in Zellkulturmedien. Verwenden Sie die Medien, dass die Zellen werden normalerweise in. wachsen die Zellen über Nacht bei ihr angegebenen Kulturbedingungen kultiviert. Die Zellen sind zwischen 50 bis 70% konfluent sein am Tag der Transduktion. Am Tag der Transduktion, saugen die Medien aus den Zellen. Kombinieren Sie Kulturmedium mit TransDux zu einer Endkonzentration 1 x (z. B. 2,5 ul TransDux zu 500 ul Kulturmedium). Übertragen Sie anschließend die TransDux-CEll Kulturmedium Mischung in jede Vertiefung. Pipettieren Sie das entsprechende Volumen des Virus, das auf die optimale MOI für die Zielzellen in jede Vertiefung entspricht. Wenn der optimale MOI unbekannt ist, empfehlen wir versuchen eine Reihe von verschiedenen MOI (z. B. einer MOI von 1, 2 und 5 für einfach zu infizieren Gewebekulturzellen, und einer MOI von 1, 10 und 20 für mehr schwer -primären Zellen zu infizieren). Wenn die Konzentration der lentiviralen Partikel nicht bekannt ist (wie durch einen Virus Titrierung Protokoll bestimmt) können unterschiedliche Mengen des Virus getestet, zum Beispiel 1, 2 und 5 ul-Virus werden. Das Virus kann in Kontakt mit den Zielzellen bleiben bis zu 72 Stunden. Weitere Experimente mit den transduzierten Zielzellen-von-Interesse kann begonnen werden 72 Stunden nach Transduktion, wenn die viralen Konstrukts in das Genom der Wirtszelle integriert ist. Ändern Sie den mittel-und Durchgang der Zielzellen-of-Interest entsprechend ihren spezifischen Bedürfnissen. 4. Repräsentative Ergebnisse <pclass = "jove_step"> Transfektion von Zellen 293TN Der Ausgangspunkt Dichte der 293TN Zellen ist entscheidend für eine erfolgreiche virale Verpackung. 293TN Zellen müssen zwischen 60 bis 80% konfluent Tag der Transfektion (2). Wenn die 293TN Zellen weniger als 60% konfluent sind, damit sie für ein paar Stunden, bevor die Transfektionseffizienz zu wachsen. Wenn die 293TN Zellen> 80% konfluent sind, sollten sie vor der Transfektion ausplattiert werden. Bei Verwendung eines lentivector GFP exprimieren, sollte mindestens 90% der Zellen fluoreszieren 293TN grün 24 Stunden nach der Transfektion, die eine erfolgreiche Transfektion (Abbildung 3). Wenn weniger als 90% der Zellen GFP-positiv sind, nicht zu dem nächsten Schritt fort, da dies anzeigt, dass die Transfektion nicht erfolgreich war, und die viralen Titer niedrig sein wird. Stattdessen neue Platte 293TN Zellen und von vorn beginnen, um sicherzustellen, dass die 293TN Zellen an der richtigen Zelldichte sind vor Transfektion. 293TN Zellen können Abziehen des Gewebekulturplatten 48-72 Stunden nach der Transfektion. Dies gilt nicht negativ auf die Produktion von lentiviralen Partikeln. Titrieren mit HT1080-Zellen Virale Titer kann unter Verwendung SBI Global ultraschnellen Titrierung Kit nach den Anweisungen des Herstellers werden. Dieses System verwendet, um virale Integration qPCR der WPRE Sequenz aus der lentiviralen Vektors in HT1080-Zellen zu messen und vergleicht diese mit einer Standardkurve, basierend auf einer genomischen Referenzsequenz genau zu messen infektiösen Einheiten pro ml (Abbildung 4). Transduktion von Zielzellen Bei Verwendung von lentiviralen Partikel Ausdruck einer konstitutiv aktive GFP-Markierung, sollte GFP-positiven Zellen anfangen, innerhalb von 12-24 Stunden nach der Transduktion erscheinen, wenn die Reaktion Transduktion funktioniert. GFP-Expression sollte auch weiterhin nach dem lentiviralen Konstrukt stabil in ter Wirtszellgenom. Wenn Transduktion mit unterschiedlichen MOIs, sollte die GFP-Fluoreszenz ungefähr der MOI, wo niedrige MOIs zeigen weniger GFP-Fluoreszenz und höhere MOIs zeigen erhöhte GFP-Fluoreszenz (Abbildung 5). 1. Überblick über die virale Produktion Protokoll. Die lentivector und PPACK Verpackung Plasmide werden gemischt und in 293TN Zellen co-transfiziert. Nach 48 -72 Stunden, wird die virale Überstand gesammelt und viralen Partikel werden mit PEG-it ausgefällt. Nach Titrierung der lentiviralen Partikel, können sie verwendet, um die Zielzellen-of-Interest transduzieren werden. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen . Abbildung 2. Phasenkontrast-Bild von 293TN Zellen. Zelle Density sollte zwischen 60-80% konfluent Tag der Transfektion werden. 3. Fluoreszenzbild von GFP-positiven 293TN Zellen 24 Stunden nach Transfektion mit Purefection, pPACKH1, und lentivector GFP-codierenden Konstrukts. Abbildung 4. WPRE qPCR Ergebnisse und Standardkurve unter Verwendung SBI Global ultraschnellen Titrierung Kit MOI und entsprechende Titer von verpackten viralen Partikel berechnen. Bild 5. Fluoreszenzbilder von HT1080-Zellen transduziert mit steigenden Mengen von Lentivirus. Bilder von 72 Stunden nach der Transduktion.