レンチウイルス発現ベクターは安定し、哺乳動物細胞と生物全体を分割し、非分裂で異なるエフェクター分子またはレポーターコンストラクトを発現させるための最も効果的な車である。ここでは、pseudoviral粒子にlentivector発現構築物をパッケージ化するとpseudoviral粒子を用いた標的細胞を形質導入するためにどのようにプロトコルを提供しています。
標準的なプラスミドベクターと同様に、エフェクターの一過性の発現を得るために低〜中程度の効率で細胞内にプラスミドの形でlentivectorsをトランスフェクトすることが可能です。 pseudoviral粒子にパッケージングレンチウイルス発現構築物は、しかし、さらに困難なトランスフェクションは、プライマリ、幹細胞などの細胞、および分化した細胞で、100%の伝達まで可能になります。また、レンチウイルスの配信は、典型的には、トランスフェクション試薬1、2の毒性に起因する細胞死などの化学的トランスフェクションに関連付けられた特定の細胞応答を生成しません。標的細胞に導入する場合は、レンチウイルスコンストラクトはゲノムDNAに統合され、小さなヘアピンRNA(shRNA)は、cDNA、RNAまたはレポーター遺伝子3、4の安定な発現を提供しています。安定的にエフェクター分子を発現する標的細胞は、発現ベクターなどピューロマイシンまたはGFPとして構築中に含まれる選択可能なマーカーを用いて単離することができます。後のPSウイルスの構造遺伝子が存在しないと、長い末端反復配列(LTRの)が伝達5、6に自己不活性化するように設計されているため、eudoviral粒子は標的細胞に感染し、彼らは標的細胞内で複製することはできません。
効率的なレンチウイルスパッケージング1、5、6、7のために必要な3つの主要コンポーネントがあります。
ウイルス産生プロトコルの概要を図1に見ることができます。ウイルス産生は、レンチウイルス発現ベクターおよびパッケージングプラスミドと共トランスフェクト293TNプロデューサー細胞によって開始されます。ウイルス粒子が培地中に分泌されています。 48〜72時間後の細胞培養培地を収穫しています。細胞の破片は、細胞培養培地から削除され、ウイルス粒子は、濃度のPEG-それとを遠心分離によって沈殿させる。生産レンチウイルス粒子は、力価測定され、標的細胞を形質導入するために使用することができます。ウイルスタイターの詳細については、このプロトコルに含まれていませんが、で見つけることができます:
ANK "> http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8。
このプロトコルは、示された特定の製品を使用して最適化されています。他の試薬は置換されていてもよいが、同じ結果が保証されません。
このウイルスのパッケージングと標的細胞のプロトコルの伝達は、SBIのウイルスのパッケージング試薬の使用に最適化されています。他の試薬の置換は、プロトコルの結果に影響を及ぼす可能性があります。このプロトコルは、レンチウイルス生産用に最適化されており、ウイルスやpseudoviruses他の種類の製造に適しないかもしれません。
成功したウイルスのパッケージングは、いくつかの重要なステップに依存しています。 293TN細胞は、細胞培養上清中にレンチウイルス粒子の分泌のために絶対に必要であるSV40ラージT抗原を発現する。 293TN細胞はトランスフェクション時のもので、その密度が十分に細胞にlentivectorとパッケージングプラスミドを転送するPureFection試薬ためには特に重要です。徹底的にプレートを渦巻く続いて滴下方法で組織培養プレートにPureFection混合物を追加すると、パッケージングプラスミドの分散のために重要であるとlentivectorは、細胞のすべてにわたって構築します。適切にベクトルを配布するための障害は、生産されて不十分なレンチウイルス粒子になることがあります。ウイルスのパッケージング反応が組織培養プレートの表面積に基づいて、高力価のウイルスの生産のためにスケールアップすることができます。一つは、パッケージ化する必要がありますコンストラクト当たり293TN細胞のプレート、いくつかの組織培養皿に選択することができます。ウイルス上清の濃度が高力価のウイルスを作成する上で特に便利です。細胞の複数のプレートからウイルス上清は 、in vivo実験で 、または形質導入することは困難である細胞の使用のために組み合わせて、濃縮することができる。
生産レンチウイルス粒子をタイターは、標的細胞の形質導入に使用する正確なMOIを計算するために重要である。与えられた伝達に使用されたMOIを知ることは情報伝達が成功しない場合にトラブルシューティングが可能になります。たとえば、MOI、つまりを使用してが低すぎるコンストラクト·オブ·関心を非常に少数の標的細胞になることがあります。 MOIが高すぎるそれを使用して、しかし、ストレスの兆候を示す標的細胞になることがあります。目標は、MOI細胞の健康を維持しながら、コンストラクト·オブ·関心の表現を最大限にそれを使用することです。我々はHT1080細胞内でレンチウイルスコンストラクトの統合されたコピーを測定する定量PCRベースのタイタープロトコルをお勧めしますが、他のタイターのアプローチはまた、p24をELISAまたはGFP-陽性細胞の割合の推定として、使用することができます。
標的細胞の正常な伝達には、いくつかの重要な要因に依存しています。 TransDuxは、高い伝達効率を可能にするユニークな感染試薬であるが、それは細胞に毒性はありません。 TransDuxは、多くの場合、標的細胞への毒性があるポリブレンの代わりに使用することができます。標的細胞の形質導入におけるTransDuxの包含は、ウイルス粒子上の電荷を中和するのに役立ち、細胞内にウイルスを許可するだ。 TransDuxは細胞に有毒ではないので、1は、このように確率を増加させる、レンチウイルス粒子は最大72時間の細胞(ウイルスのコンストラクトが宿主細胞のゲノムに組み込まれていた時刻)と接触したままできるようにすることができますウイルス粒子は細胞を入力します。いくつかの困難な形質導入細胞については、形質導入は、導入効率を高めるために連続した日に繰り返すことができます。たとえば、1日目の細胞に形質導入、細胞は2日目に休息することができますし、3日目に再び細胞を形質導入する。標的細胞の選択、さらに実験や特性評価を開始する前に、最後の伝達後72時間を待つことが重要である。
効率的なウイルスのパッケージングは、5 'および3'LTR領域との間でも、レンチウイルスコンストラクトのサイズに依存しています。レンチウイルスコンストラクトのこのセクションでは、ネイティブのHIVゲノムのサイズに相当する、約9キロバイト以下にする必要があります。 9キロバイト月ドを超えて生産pseudoviral粒子のしわ価。新技術は、このようなpiggyBacトランスポゾンベクターとしては、最大1回のトランスフェクションを介して100キロバイトへの導入遺伝子の信頼性の高い、安定した統合を可能にします。このアプローチは、それが標的細胞をトランスフェクトすることが可能となり、ウイルスのパッケージング工程9,10を必要としない付加的な利点を提供する場合にはレンチウイルスベクターのサイズ制限を超えて構造体に使用することができます。
このプロトコルを使用して製造pseudoviral粒子は、それらはほとんどの哺乳動物の細胞型を感染させることができるという点で感染性である。このプロトコルで使用される製品は、しかし、彼らは非複製と自己不活性化pseudovirusesを生成するという点で、第三世代のbiosafeです。したがって、一度標的細胞または動物に導入、標的細胞または動物が伝染性ではありません。バイオからお勧めできませんが、第三世代のbiosafeではありません他のlentivectorプラスミドの置換が可能です。視点。標的細胞のウイルス産生のプロトコルと、後続の伝達は、NIHのガイドライン11に従って、バイオセーフティレベル2の下で実施されるべきであり、ウイルス粒子を取り扱う際には研究者は常に白衣や手袋を着用しなければならない。使用293TNプロデューサー細胞は、ウイルス粒子のチューブと使い捨てピペットは、適切なバイオハザード容器に廃棄する必要があります。再利用可能なピペットとガラス製品は、漂白剤で除染と人員の暴露を減らすためにオートクレーブする必要があります。
The authors have nothing to disclose.
我々は、これらのプロトコルの開発とテストでのサポートのためにSBIのスタッフと科学者に感謝します。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM High Glucose Medium | Gibco | 11995-073 | |
293TN Cells | SBI | LV900A-1 | |
pPACKH1 | SBI | LV500A-1 | For HIV-based lentivectors |
pPACKF1 | SBI | LV100A-1 | For FIV-based lentivectors |
Any Lentiviral vector | SBI | Various | cDNA, shRNA, microRNA, transcription reporters |
PureFection | SBI | LV750A-1 LV750A-5 |
|
PEG-it | SBI | LV810A-1 LV825A-1 |
|
Global UltraRapid Titering kit | SBI | LV961A-1 | Not described in this protocol, but needed to titer the viral particles |
TransDux | SBI | LV850A-1 |