La quantification et l'analyse de la formation de HO-endonucléase Stimulé par les translocations chromosomiques simple brin recuit dans Saccharomyces cerevisiae</em

1. Fréquences translocation HO-stimulé Inoculer 10-20 indépendante cultures de 1 ml de YPGly / Lac moyenne (1% extrait de levure, peptone à 2%, glycérol 3% et 3% de lactate) avec des colonies isolées du génotype désiré. Incuber les cultures de la nuit, ou pendant une durée suffisante pour atteindre une densité cellulaire d'environ 5×10 7-1×10 8 cellules / ml, à 30 ° C sur un agitateur, ou avec une légère agitation. Ajouter galactose à la culture à une concentration finale de 2% pour induire HO endonucléase dirigée CDB à l'his3-Δ3 »(chromosome III) et his3-Δ5» (chromosome XV) substrats de translocation. Incuber pendant 4 h à 30 ° C sur un agitateur, ou avec une légère agitation. Après 4 h, les dilutions plaque appropriée des cultures sur YPD (extrait de levure 1%, 2% de peptone, 2% de dextrose) pour donner environ 100 à 200 colonies par plaque, et un nombre suffisant de cellules sur milieu dépourvu d'histidine à céder une observable nombre de ses colonies + recombinant. Incuber les plaques à 30 ° C pendant deux à trois jours. REMARQUE: Etape 1.4 décrit la détermination des fréquences de la translocation dans des conditions sélectives en étalant les cultures sur l'histidine manquent moyenne. Ce test peut également être menée sous conditions non sélectives en étalant sur des cultures YPD, puis réplique-placage des colonies qui se posent sur-Sa plaques deux à trois jours plus tard. Ces méthodes produisent des fréquences similaires de translocation (figure 2C). Déterminer la fréquence de translocation en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine par le nombre total de cellules viables plaqués (déterminé par dilutions placage sur YPD). Déterminer la fréquence médiane et la translocation 95% intervalle de confiance 15. 2. Efficacités Placage Retirer une aliquote de cellules de chaque culture de la nuit, et de déterminer le nombre de cellules par hématimètre count (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1). Plaque d'environ 100 à 200 cellules en utilisant une dilution appropriée sur YPD. Incuber pendant deux à trois jours à 30 ° C (par exemple pour une culture avec une densité cellulaire de 1×10 8 cellules / ml, on devrait plaque de 100 à 200 pi d'une dilution 10-5 par plaque). Ajouter galactose à 20% pour les cultures à une concentration finale de 2%. Après 4 h, enlever une partie aliquote de cellules de chaque culture, de déterminer le nombre de cellules par comptage hématimètre, et la plaque d'environ 100 à 200 cellules en utilisant une dilution appropriée sur YPD. Incuber pendant deux à trois jours à 30 ° C. Déterminer l'efficacité plaquage en divisant le nombre de colonies apparaissant sur YPD par le nombre de cellules étalées, et en multipliant ce quotient par 100. Déterminer le pourcentage médian avec un intervalle de confiance à 95%. 3. Genomic analyse par Southern blot Sélectionnez une seule colonie de Sa + recombinantes à partir de chaque essai indépendant et préparer l'ADN génomique 16. Recueil d'environ 4 pg d'ADN par l'endonucléase de restriction BamHI. Séparée digéré par BamHI de fragments sur un gel d'agarose 0,7%, et le transfert d'une membrane de nylon chargée positivement (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) 17. S'hybrider avec une 32 P-sonde marquée obtenus par amorçage aléatoire (Amersham Biosciences Code du produit:. RPN1604) avec un 1,8 kb BamHI / BamHI clone génomique contenant le gène HIS3. Visualisez les fragments d'ADN par autoradiographie ou phosphorimaging. 4. Une analyse par transfert de chromosomes en utilisant des chromosomes séparés dans un contour serré homogène du champ électrique (CHEF): Préparer les chromosomes de ses recombinants sélectionnés + dans les bouchons d'agarose 18: Cultiver une culture liquide de Son candidat + TXV:: III chromosome recombinant contenant dans 5 ml de YPD à environ 1-2 x 10 8 cellules / ml. Isoler et laver les cellules deux fois avec 50 mM d'EDTA. Resuspendre les cellules dans environ 200 pi d'EDTA 50 mM, et chaude à 50 ° C. Ajouter un volume égal de liquide de 2% (p / v) faible fondre agarose portée à 50 ° C, bien mélanger. Répartir environ 80 aliquotes dans des moules fiche, et les laisser refroidir pendant 30 min à 4 ° C. Extruder les bouchons du moule dans un plat de 12 puits. Jusqu'à cinq fiches peuvent être placés dans chaque puits. Ajouter 3 ml de solution sphéroplastes fraîchement préparés (14 mM de 2-β-mercaptoéthanol, 20 mM d'EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 M sorbitol) à chaque puits. Incuber à 37 ° C pendant 4 heures avec une agitation douce. Retirer et remplacer la solution sphéroplastes avec 3 ml de solution de LDS (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 100 mM d'EDTA, 1% (p / v) de dodécylsulfate de lithium, adjuspH à 8,0 t). Incuber à 37 ° C pendant 15 min avec agitation douce. Retirer solution de LDS et le remplacer par une autre partie aliquote de 3 ml de LDS. Incuber à 37 ° C pendant une nuit sous agitation douce. Retirer et remplacer LDS avec 3 ml de 0,2 X NDS (0,6 g de Tris base, 93 g EDTA disodique dihydraté, 5 g de N-lauroyl sarcosine, ajuster le pH à 8,0, porté à 500 ml avec dH 2 O). Incuber à température ambiante pendant 30 min avec agitation douce. Retirer NDS, et répéter 2 fois. Retirer et remplacer NDS avec 3 ml de TE. Laver avec une légère agitation pendant 30 min à température ambiante. Répétez 4 fois. Magasin de bouchons à 4 ° C dans 2 ml de TE. Bouchons peut se conserver jusqu'à un an. Chromosomes distincts sur un gel à 1% d'agarose en utilisant un Bio-Rad CHEF-DRII appareil à 14 ° C (Catalogue #: 170-3612). Paramètres: 1 Bloc er: changer l'heure 70, 15h à 6V/cm. 2 ème bloc: changer l'heure 120s, 11h au 6V/cm Visualisez les chromosomes par coloration au bromure d'éthidium 1μg/ml pendant 30 min, irradiant avec 60 mJ d'UV dans un Stratalinker UV (Stratagene), et de-coloration pendant 30 min dans dH 2 O. Irradiant de bromure d'éthidium chromosomes colorés entailles de l'ADN pour permettre le transfert efficace de la membrane. Transfert des chromosomes à une membrane chargée positivement (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) par capillarité dans les conditions dénaturantes (NaOH 0,4 N, 1,5 M de NaCl). S'hybrider avec une 32 P-sonde marquée obtenus par amorçage aléatoire (Amersham Biosciences Code du produit:. RPN1604) avec un clone génomique de 1,8 kb BamHI / BamHI contenant le gène HIS3 17. Visualisez les chromosomes par autoradiographie ou phosphorimaging. 5. Les résultats représentatifs: Une représentation graphique de l'essai de translocation est représenté au niveau chromosomique (Figure 1). Un schéma de la procédure expérimentale est également affichée (figure 2A). Les deux pré-et efficacités plaquage post-induction sont déterminés en divisant le nombre total de cellules viables colonie, formant par le nombre total de corps cellulaires dans la culture déterminée par hématimètre comptage (figure 4B). Pré-et de l'efficacité plaquage post-induction ne sont pas significativement différentes pour les cellules de type sauvage (valeur p = 0,1400) (tableau 1). Tableau 1. Pré-et de l'efficacité plaquage post-induction dans les cellules de type sauvage. a Le nombre de corps cellulaires par millilitre sont déterminées par comptage hématimètre. b Le nombre de cellules viables par millilitre sont déterminées par étalement des dilutions appropriées sur milieu non sélectif pour produire ~ 100-200 colonies. c Les pré-et efficacités plaquage post-induction sont déterminés en divisant le nombre total d'entreprises viables, formant colonie, les cellules par le nombre total de corps cellulaires dans la culture, déterminée par le nombre hématimètre. Cela suggère que la présence ou l'absence d'une translocation chromosomique soit n'affecte pas la capacité de survivre à la formation de l'ORD. La fréquence des translocations chromosomiques peuvent être calculés en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine par le nombre total de cellules viables déterminé par étalement sur ​​YPD (figure 2B). Ce test peut être effectué en utilisant des souches de génotype différent de déterminer comment la perte de la fonction des protéines affecte l'Afrique subsaharienne (soit rad51Δ – / -). Fréquences de recombinaison déterminée dans différentes souches peuvent alors être représentées graphiquement pour comparer les différences dans la capacité de ces souches pour réparer les CDB endonucléase HO-induite par l'ASS (figure 2C). Translocation fréquences obtenues avec la souche diploïde sauvage de type en vertu sélective (2.2×10 -2) et non sélectif (2.17×10 -2) les conditions n'étaient pas statistiquement différents les uns des autres (valeur p = 0,9131), tandis que les fréquences obtenues translocation sélective (6.0×10 -2) et non sélective (11.9×10 -2) avec le rad51Δ – / – homozygotes étaient similaires, mais statistiquement différentes (valeur p = 0,0089). Les fréquences obtenues à la fois sélective (valeur p = 0,0001) et non sélective (valeur p = 0,0002) avec le ¨ Rad51 – / – homozygotes étaient statistiquement différents de ceux obtenus en utilisant les conditions correspondant à la souche de type sauvage. Putatifs translocation portant des clones peut être encore examiné par Southern blot génomiques et les analyses chromosomiques (figure 3). Pour une analyse de Southern, l'ADN génomique est digéré par une endonucléase BamHI avant électrophorèse sur gel, buvard et d'hybridation pour une 32P-étiquetés 1.8kb HIS3 sonde pour visualiser le diagnostic de 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 ko TIII:: XV, 5 ko TXV:: III, et 8 ko his3-Δ5 «fragments (figure 3B.1) . Chromosomes intacts peuvent être préparés, séparés par le chef (figure 3B.2), effacés au nylon et hybrides avec le P-32 étiqueté 1,8 kb HIS3 sonde pour visualiser les chromosomes intacts 1.1 Mo XV, 0,8 Mb TXV: chromosome translocation III, 0.6 Mo TIII: chromosome translocation XV, et de 0,3 Mb du chromosome III intacte (figure 3B.3). Une carte graphique illustrant devrait BamHI endonucléase digérée fragments d'ADN génomique, et les parents et les chromosomes recombinants, est représenté (figure 3A). Figure 1. Formation des chromosomes par translocation simple brin recuit (ASS). 1) CDB sont créés à l'his3-Δ3 et his3-Δ5 «substrats (chromosomes XV et III, respectivement) par endonucléase HO suite à l'ajout de galactose à la culture. 2) CDB sont traitées pour produire 3 'simple-brins aux extrémités des chromosomes cassés. 3) recuits machines ASS 311 nucléotides complémentaires ou 60 simple brin HIS3 séquences formées à chacun des substrats de recombinaison. Non homologue queues formées lors de recuit sont éliminés par digestion par des endonucléases. Complémentaire quatre surplombe pb sur les fragments restants chromosomiques formé par la digestion d'endonucléase HO-peut aussi recuit. 4) La ligature conclut la création d'un gène HIS3 intacte et TXV:: chromosome translocation III par l'ASS. Cellules porteuses du chromosome présent peuvent être sélectionnées par leur capacité à croître sur l'histidine manquent moyenne. La ligature peut aussi générer la réciproque TIII:: chromosome translocation XV par un mécanisme de NHEJ-like. Figure 2. Essai pour déterminer la fréquence de la translocation par le SSA. A) Un ml YPGly / Lac cultures sont inoculées avec des colonies de cellules unique d'un génotype de sélectionner et s'est développée à une densité appropriée d'environ 5×10 7-1×10 8 cellules / ml. Le galactose est ajouté à une concentration finale de 2% pour créer des CDBs dans les substrats de recombinaison des chromosomes III et XV. Pour effectuer le test dans des conditions sélectives, des dilutions appropriées sont faites de telle sorte que d'environ 100 à 200 cellules sont étalées sur YPD et un nombre suffisant de cellules sont étalées sur l'histidine manquent moyenne pour produire un certain nombre de ses colonies observables + recombinant. Pour effectuer le test sans sélection, environ 100 à 200 cellules sont étalées sur YPD, cultivées pendant deux à trois jours pour des colonies isolées puis réplique plaquée sur l'histidine milieu dépourvu. B) la fréquence de translocation peut être déterminé en divisant le nombre de colonies qui poussent sur-Sa plaques par la fraction qui poussent sur YPD. C) Les fréquences translocation des souches de génotype différent (c'est à dire de type sauvage et rad51Δ – / -) peuvent être représentées graphiquement pour comparer les différences dans la capacité de ces souches pour réparer les CDB en Afrique subsaharienne. Figure 3. Déterminer l'efficacité de placage. (A) Une aliquote de cellules est tirée de la culture de la nuit avant et après l'induction ORD, des dilutions appropriées sont prises, suivie par un nombre de hématimètre pour déterminer le nombre total de corps cellulaires par ml de culture. Des dilutions appropriées sont étalées sur un milieu non sélectif pour déterminer le nombre total de cellules viables par ml, en comptant les colonies qui apparaissent sur YPD. (B) L'efficacité d'étalement est alors déterminé en divisant le nombre total de cellules viables par le nombre total de corps cellulaires, et en multipliant ce quotient par 100. Figure 4. Détection des événements translocation chromosomique par Southern blot génomiques et analyses par transfert de chromosomes. A) Représentation graphique des chromosomes concernés avant (à gauche) et après la formation de translocation (à droite). Tailles des parents et des chromosomes recombinés sont énumérés dans mégabase paires (Mo). Tailles des fragments de restriction contenant des séquences pertinentes générées par digestion BamHI de l'ADN génomique de parent et les souches recombinantes, et a révélé sur des transferts par hybridation avec un clone de 1,8 kb BamHI HIS3 génomique, sont énumérés dans kilobase-paires (ko). Les chromosomes ne sont pas dessinés à l'échelle. B) Analyse physique de putatifs translocation portant des clones. (1) L'analyse génomique par Southern blot – ADN génomique a été recueilli et digéré par l'endonucléase de restriction BamHI, fractionné par électrophorèse sur gel, blotted au nylon, et hybridé à un P-32 étiqueté 1,8 kb HIS3 sonde pour visualiser les fragments suivants: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 ko TIII:: XV, 5 ko TXV:: III, et 8 ko his3-Δ5 ». Lanes: un parent diploïde), b) Son + non réciproques translocation recombinantes, c) Sa translocation réciproque + recombinant. (2) CHEF gels – chromosomes intacts ont été préparées dans les bouchons d'agarose, séparés par le chef, coloré avec du bromure d'éthidium et visualisé sous lumière UV. Lanes: Comme ci-dessus. (3) efface chromosomes – chromosomes séparés ont été effacés au nylon et hybrides avec le P-32 étiqueté 1,8 kb HIS3 sonde pour visualiser les chromosomes suivants: 1.1 Mo chromosomes intacts XV, 0,8 Mb TXV: chromosome translocation III, 0,6 Mb TIII: translocation XV chromosome, et de 0,3 Mb du chromosome III intacte. Lanes: Comme ci-dessus.