Quantifizierung und Analyse der Bildung von HO-Endonuklease Stimulated chromosomalen Translokationen von Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae</em

1. HO-stimulierte Translokation Frequenzen Impfen 10-20 unabhängige 1 ml Kulturen YPGly / Lac Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 3% Glycerin und 3% Lactat) mit einzelnen Kolonien der gewünschten Genotyp. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht oder für eine ausreichende Zeit, um eine Zelldichte von ca. 5×10 7-1×10 8 Zellen / ml zu erreichen, bei 30 ° C auf einem Rotator, oder unter leichtem Schütteln. Add Galaktose, die Kulturen zu einer Endkonzentration von 2% auf HO-Endonuklease-directed DSBs am his3-Δ3 '(Chromosom III) und his3-Δ5' (Chromosom XV) Translokation Substrate zu induzieren. Inkubieren für 4 h bei 30 ° C auf einem Rotator, oder unter leichtem Schütteln. Nach 4 h, Platte geeigneter Verdünnungen der Kulturen auf YPD (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose) zu ergeben rund 100 bis 200 Kolonien pro Platte, und eine ausreichende Anzahl von Zellen auf Medium ohne Histidin zu einem beobachtbaren Rendite Anzahl der Seine + rekombinanten Kolonien. Die Platten bei 30 ° C für zwei vor drei Tagen. HINWEIS: Schritt 1.4 beschreibt die Bestimmung der Translokation Frequenzen unter selektiven Bedingungen durch Ausplattieren der Kulturen auf Medium ohne Histidin. Dieser Test kann auch unter nicht-selektiven Bedingungen durch Ausplattieren Kulturen auf YPD durchgeführt werden, und dann Replika-Plattierung der Kolonien, die auf-His-Platten entstehen zwei vor drei Tage später. Diese Methoden führen zu ähnlichen Frequenzen der Translokation (Abbildung 2C). Bestimmen Sie die Translokation Frequenz, indem die Anzahl von Histidin prototrophen Kolonien durch die Gesamtzahl der lebenden Zellen plattiert (bestimmt durch Ausplattieren Verdünnungen auf YPD). Bestimmen Sie den Median Translokation Frequenz und 95% Konfidenzintervall 15. 2. Plating Effizienz Nehmen Sie ein Aliquot von Zellen aus jeder Nacht-Kultur, und bestimmen Sie Zellzahl durch Hämazytometer count (Baxter Healthcare Corporation Katalogcode #:. B3178-1). Platte ca. 100 bis 200 Zellen mit Hilfe einer geeigneten Verdünnung auf YPD. Inkubieren zwei vor drei Tagen bei 30 ° C (zB für eine Kultur mit einer Zelldichte von 1×10 8 Zellen / ml, sollte eine Platte 100-200 ul einer 10-5 Verdünnung pro Platte). Fügen Sie 20% Galaktose, die Kulturen zu einer Endkonzentration von 2%. Nach 4 h, entfernen Sie ein Aliquot von Zellen aus jeder Kultur, zu bestimmen Zellzahl durch Hämazytometer zählen, und die Platte ca. 100 bis 200 Zellen mit Hilfe einer geeigneten Verdünnung auf YPD. Inkubieren zwei vor drei Tagen bei 30 ° C. Bestimmen Sie die Platierungseffizienz, indem die Anzahl der Kolonien, die auf YPD durch die Anzahl der Zellen ausplattiert und Multiplikation dieses Quotienten mit 100. Bestimmen Sie die prozentuale Zentralwert mit einem 95%-Konfidenzintervall. 3. Genomic Southern-Blot-Analyse Wählen Sie ein einzelnes Sein + rekombinanten Kolonie von jedem unabhängigen Studie und bereitet genomische DNA 16. Digest ca. 4 ug DNA mit BamHI Restriktionsendonuklease. Separate BamHI verdauten Fragmente auf einem 0,7% Agarosegel und Transfer zu einem positiv geladenen Nylonmembran (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) 17. Hybridisieren mit einer 32 P-markierten Sonde durch Random-Priming (Amersham Biosciences Product Code.: RPN1604) erhalten mit einem 1,8 kb BamHI / BamHI genomische Klon, der das HIS3-Gen. Visualisieren DNA-Fragmente durch Autoradiographie oder Phosphorimaging. 4. Chromosome-Blot-Analyse unter Verwendung Chromosomen getrennt in eine Kontur-geklemmt homogenes elektrisches Feld (CHEF): Bereiten Chromosomen aus ausgewählten His +-Rekombinanten in Agarose-Plugs 18: Wachsen eine flüssige Kultur des His + Kandidat TXV:: III-Chromosom-haltigen rekombinanten in 5 ml YPD auf ca. 1-2 x 10 8 Zellen / ml. Spin nach unten und waschen Sie die Zellen 2 mal mit 50 mM EDTA. Die Zellen in ca. 200 ul 50 mM EDTA, und warm bis 50 ° C. Fügen Sie dem gleichen Volumen von geschmolzenem 2% (w / v) Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt auf 50 ° C, gründlich mischen. Dispense etwa 80 ul Aliquots in Plug Formen, und es ihnen ermöglichen, für 30 min bei 4 ° C abkühlen Extrude Stecker aus der Form zu einer 12-well Schale. Bis zu fünf Stecker können in jede Vertiefung gegeben werden. 3 ml frisch zubereitete Spheroplasting Lösung (14 mM 2-β-Mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M Sorbitol) in jede Vertiefung. Bei 37 ° C für 4 Stunden unter leichtem Schütteln. Entfernen Spheroplasting Lösung und ersetzen mit 3 ml LDS-Lösung (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) Lithium-Dodecylsulfat, einstellbart pH bis 8,0). Bei 37 ° C für 15 min unter leichtem Schütteln. Entfernen LDS-Lösung und durch ein anderes ersetzen 3 ml Aliquot LDS. Bei 37 ° C über Nacht unter leichtem Schütteln. Entfernen Sie LDS und ersetzen mit 3 ml 0,2 X NDS (0,6 g Tris Base, 93 g Dinatrium-EDTA, 5 g N-Lauroylsarcosin, pH-Wert auf 8,0, brachte auf 500 ml mit dH 2 O). Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min unter leichtem Schütteln. Entfernen Sie NDS, und wiederholen Sie 2 mal. Remove NDS und ersetzen mit 3 ml TE. Wash unter leichtem Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die 4-fache. Shop-Stecker auf 4 ° C in 2 ml TE. Plugs können für immer bis zu einem Jahr. Separate Chromosomen auf einem 1% Agarosegel unter Verwendung eines Bio-Rad CHEF-DRII Apparatur bei 14 ° C (Catalog #: 170-3612). Parameter: 1. Block: 70er Zeit umschalten, 15h am 6V/cm. 2. Block: 120s Zeit umschalten, 11h am 6V/cm Visualisieren Chromosomen durch Färbung mit 1μg/ml Ethidiumbromid für 30 min, Bestrahlung mit 60 mJ der UV in einem UV Stratalinker (Stratagene) und de-Färbung für 30 min in dH 2 O. Bestrahlung mit Ethidiumbromid gefärbten Chromosomen nicks der DNA, um eine effiziente Übertragung auf die Membran zu erlauben. Transfer-Chromosomen auf eine positiv geladene Membran (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) durch Kapillarwirkung in denaturierenden Bedingungen (0,4 N NaOH, 1,5 M NaCl). Hybridisieren mit einer 32 P-markierten Sonde durch Random-Priming (Amersham Biosciences Product Code.: RPN1604) erhalten mit einem 1,8 kb BamHI / BamHI genomische Klon, der das HIS3-Gen 17. Visualisieren Chromosomen durch Autoradiographie oder Phosphorimaging. 5. Repräsentative Ergebnisse: Eine grafische Darstellung der Translokation Test ist bei der chromosomalen Ebene (Abbildung 1) dargestellt. Eine schematische Darstellung des experimentellen Verfahren wird auch angezeigt (Abbildung 2A). Sowohl Pre-und Post-Induktion plating Wirkungsgrade werden durch Teilung der gesamten Anzahl der lebensfähigen, Kolonie-bildenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellkörper in der Kultur durch Hämazytometer count (Abbildung 4B) bestimmt wird. Pre-und Post-Induktion plating Effizienz unterschieden sich nicht signifikant für Wildtyp-Zellen (p-Wert = 0,1400) (Tabelle 1). Tabelle 1. Pre-und Post-Induktion plating Effizienz in Wildtyp-Zellen. a Die Zahl der Zellkörper pro Milliliter sind Hämazytometer count bestimmt. b Die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Milliliter sind durch Ausplattieren geeigneter Verdünnungen auf nicht-selektiven Medium ~ 100-200 Kolonien produzieren bestimmt. c Die Pre-und Post-Induktion plating Effizienz wird durch Division der Gesamtzahl der ermittelten lebensfähigen koloniebildenden, Zellen durch die Gesamtzahl der Zellkörper in die Kultur, die durch Hämazytometer count bestimmt. Dies deutet darauf hin, dass das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von entweder Translokation Chromosom hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit, DSB Bildung überleben. Die Häufigkeit von chromosomalen Translokationen können, indem die Anzahl von Histidin prototrophen Kolonien durch die Gesamtzahl der lebenden Zellen durch Ausplattieren auf YPD (Abbildung 2B) bestimmt berechnet werden. Dieser Test kann unter Verwendung Stämme von unterschiedlichen Genotyp zu ermitteln, wie Verlust der Funktion von Proteinen beeinflusst SSA (dh rad51Δ – / -). Rekombination Frequenzen in verschiedenen Stämmen bestimmt können dann grafisch dargestellt, um Unterschiede in der Fähigkeit dieser Stämme, die HO-Endonuklease induziert DSBs von SSA (Abbildung 2C) reparieren zu vergleichen. Translokation Frequenzen mit dem Wildtyp-diploide Stamm unter selektiven (2.2×10 -2) und nicht-selektive (2.17×10 -2) Bedingungen gewonnen wurden statistisch nicht voneinander unterscheiden (p-Wert = 0,9131), während der Translokation Frequenzen erhalten selektiv (6.0×10 -2) und nicht-selektiv (11.9×10 -2) mit dem rad51Δ – / – homozygot waren ähnlich, aber statistisch verschieden (p-Wert = 0,0089). Die Frequenzen erhalten sowohl selektiv (p-Wert = 0,0001) und nicht-selektiv (p-Wert = 0,0002) mit dem Rad51 ° – / – homozygot waren statistisch unterscheiden sich von denen unter Verwendung der entsprechenden Bedingungen mit dem Wildtyp-Stamm. Vermeintliche Translokation tragenden Klone können durch genomische Southern-Blot-und chromosomale-Blot-Analysen (Abbildung 3) untersucht werden. Für Southern-Analyse ist die genomische DNA mit BamHI Endonuklease vor Agarosegelelektrophorese verdaut, Blotting und Hybridisierung zu einem 32P-markierten 1.8kb HIS3-Sonde der diagnostischen 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb TIII:: XV, 5 kb TXV: III und 8 kb his3-Δ5' visualisieren Fragmente (Abbildung 3B.1) . Intakten Chromosomen können hergestellt werden, getrennt durch CHEF (Abbildung 3B.2), ausgelöscht zu Nylon und hybridisiert mit dem 32 P-markierten 1,8 kb HIS3 Sonde an die 1,1 Mb intakten Chromosom XV, 0,8 Mb TXV visualisieren: III Translokation Chromosom, 0,6 Mb TIII: XV Translokation Chromosom und 0,3 Mb intakten Chromosom III (Abbildung 3B.3). Eine grafische Darstellung Karte erwartet BamHI Endonuklease-verdaute genomische DNA-Fragmente, und Eltern und rekombinante Chromosomen, dargestellt (Abbildung 3A). Abbildung 1. Formation der Translokation Chromosomen von Einzelstrang-Annealing (SSA). 1) DSBs sind am his3-Δ3 'und his3-Δ5 "Substrate (Chromosomen XV und III bezeichnet) durch HO-Endonuklease nach der Zugabe von Galaktose zu den Kulturen geschaffen. 2) DSBs werden verarbeitet, um 3 'single-Stränge an den Enden des gebrochenen Chromosomen zu erzeugen. 3) SSA Maschinen glüht komplementäre 311 oder 60 Nukleotid-Einzelstrang-HIS3-Sequenzen an jedem der Rekombination Substraten. Non-homologen Schwanz durch Tempern entstehen durch Endonukleaseverdau entfernt. Ergänzende vier bp Überhängen auf den verbleibenden chromosomale Fragmente von HO-Endonukleaseverdau gebildet kann auch glühen. 4) Ligation schließt die Schaffung eines intakten HIS3-Gens und TXV: III Translokation Chromosom von SSA. Zellen, die dieses Chromosoms kann durch ihre Fähigkeit, auf Medium ohne Histidin wachsen ausgewählt werden. Ligation kann auch erzeugen die gegenseitige TIII:: XV Translokation Chromosom von einem NHEJ-ähnlichen Mechanismus. Abbildung 2. Assay zur Bestimmung der Häufigkeit der Translokation von SSA. A) Ein ml YPGly / Lac Kulturen werden mit einzelnen Kolonien von Zellen eines wählen Genotyp überimpft und eine angemessene Dichte von ca. 5×10 7-1×10 8 Zellen / ml. Galactose ist bis zu einer Endkonzentration von 2% bis DSBs bei der Rekombination Substrate auf den Chromosomen III und XV erstellen aufgenommen. Zur Durchführung des Tests unter selektiven Bedingungen sind entsprechende Verdünnungen hergestellt, so dass ungefähr 100 bis 200 Zellen auf YPD ausplattiert und eine ausreichende Anzahl von Zellen auf Medium ohne Histidin beschichtet, um eine beobachtbare Zahl Seiner + rekombinante Kolonien erhalten. Zur Durchführung des Tests ohne Selektion, sind etwa 100 bis 200 Zellen auf YPD vernickelt, angebaut für zwei vor drei Tagen bis zu einzelnen Kolonien und dann Replik auf Medium ohne Histidin ausplattiert. B) Translokation Frequenz kann durch Division der Anzahl der Kolonien, die auf-His-Platten wachsen, indem der Anteil, der auf YPD wachsen bestimmt werden. C) Die Translokation Frequenzen von Stämmen von unterschiedlichen Genotyp (dh Wild-Typ und rad51Δ – / -) können grafisch dargestellt, um Unterschiede in der Fähigkeit dieser Stämme, die DSBs von SSA Reparatur zu vergleichen. Abbildung 3. Bestimmen Platierungseffizienz. (A) Ein Aliquot von Zellen aus der Übernacht-Kultur vor und nach dem DSB-Induktion genommen werden geeignete Verdünnungen hergestellt, gefolgt von einem Hämacytometer verlassen, dass die Gesamtzahl der Zellkörper pro ml Kultur zu bestimmen. Geeignete Verdünnungen werden auf nicht-selektiven Medium ausplattiert, um die Gesamtzahl der lebenden Zellen pro ml zu bestimmen, durch Zählen der Kolonien, die auf YPD erscheinen. (B) Die Platierungseffizienz wird dann durch Division der Gesamtzahl der lebenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellkörper und Multiplikation dieses Quotienten mit 100 bestimmt. Abbildung 4. Nachweis von chromosomalen Translokation Ereignisse durch genomische Southern-Blot-und Chromosomen-Blot-Analysen. A) Graphische Darstellung der relevanten Chromosomen vor (links) und nach (rechts) Translokation Bildung. Die Größen der Eltern-und rekombinanten Chromosomen sind in Megabasen-Paaren (Mb) aufgeführt. Die Größen der Restriktionsfragmente mit entsprechenden Sequenzen von BamHI Verdau von genomischer DNA von den Eltern und rekombinanten Stämmen erzeugt, und zeigte auf Blots durch Hybridisierung mit einer 1,8 kb BamHI HIS3 genomischen Klon, sind in Kilobasen-Paaren (kb) aufgeführt. Chromosomen sind nicht maßstabsgetreu. B) Physikalische Analyse von mutmaßlichen Translokation tragenden Klone. (1) Genomic Southern-Blot-Analyse – Genomic DNA wurde gesammelt und mit BamHI Restriktionsendonuklease verdaut, gelelektrophoretisch, blotted zu Nylon und hybridisierte mit einer 32 P-markierten 1,8 kb HIS3-Sonde auf die folgenden Fragmente zu visualisieren: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb TIII:: XV, 5 kb TXV: III und 8 kb his3-Δ5 ". Lanes: a) Eltern diploid, b) Sein + nicht-reziproken Translokation rekombinanter, c) Sein + reziproken Translokation rekombinanter. (2) CHEF Gele – Intact Chromosomen wurden in Agarose-Plugs bereit, getrennt durch CHEF, mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht. Lanes: Wie oben. (3) Chromosome Blots – Separated Chromosomen wurden auf Nylon geblottet und hybridisiert mit dem 32 P-markierten 1,8 kb HIS3-Sonde auf die folgenden Chromosomen sichtbar: 1,1 Mb intakten Chromosom XV, 0,8 Mb TXV: III Translokation Chromosom, 0,6 Mb TIII: XV Translokation Chromosom und 0,3 Mb intakten Chromosoms III. Lanes: Wie oben.