HOエンドヌクレアーゼの形成の定量と分析でアニーリングシングルストランドによる染色体転座を刺激サッカロマイセスセレビシエ</em

1。 HO -刺激転座の頻度目的の遺伝子型の単一のコロニーでYPGly /ラック培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、3％のグリセロールと3％乳酸）の10-20独立した1 mlの培養液に接種する。 ° Cローテーター上で、または穏やかに振とうしながら30で、約5 × 7 × 10 8細胞/ mlの細胞密度に達するのに十分な時間、一晩、または文化をインキュベートする。 HIS3 -Δ3"（染色体III）とHIS3 -Δ5"におけるHOエンドヌクレアーゼ主導のDSBが（染色体XV）転座の基質を誘導するために2％の最終濃度に文化にガラクトースを追加。 30℃で4時間インキュベート℃でローテーター上で、または静かに撹拌する。 4の後に培地欠けヒスチジンへYPD上にH、文化のプレートに適切な希釈液（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％デキストロース）プレート当たり約100〜200個のコロニーを得ること、および細胞の十分な数は、観察を得た彼+組換えコロニーの数。 30℃でプレートをインキュベート℃で2〜3日間。 注：ステップ1.4培地欠けヒスチジンに文化をめっきすること、選択的な条件下で転座の頻度の決定を説明する。このアッセイはまた、メッキのYPD上に培養し、レプリカメッキ2〜3日後に、彼のプレートに生じるコロニーが、非選択的な条件で行うことができる。これらのメソッドは、転座の同じような周波数（ 図2C）を生成する。 播種生存細胞の合計数（YPD上にメッキの希釈によって決定される）によってヒスチジン原栄養のコロニーの数を割ることによって転座の頻度を決定します。中央転座の頻度を決定し、95％信頼区間15。 2。メッキ効率それぞれの一晩培養からの細胞のアリコートを削除し、血球計数（バクスターヘルスケアコーポレーションCatolog＃。：B3178 – 1）で細胞数を決定します。 YPD上に適切な希釈を用いてプレート約100〜200細胞。 30 ° C（ 例えば 1 × 10 8細胞/ mlの細胞密度で培養には、一皿あたり10〜5倍希釈のプレート100〜200μlのはず）で2〜3日間インキュベートする。 2％の最終濃度に培養液に20％のガラクトースを追加。 YPDに適切な希釈を用いて4時間後、、各培養物から細胞のアリコートを削除する血球計数で細胞数を決定し、そしてプレート約100〜200細胞。 30℃で2〜3日間インキュベート℃、 播種した細胞の数でYPDに表示される、と100でこの商を乗じてコロニーの数を割ることによって、めっき効率を決定する。 95％信頼区間との割合の中央値を決定します。 3。ゲノムサザンブロット解析それぞれ独立した試験から、単一の彼の+組換えコロニーを選択して、ゲノムDNA 16を準備する。 BamHI制限エンドヌクレアーゼでDNAの約4μgのダイジェスト。 別BamHIでは0.7％アガロースゲル上でフラグメントを消化し ​​、正に帯電したナイロン膜（Hybond N +、GEヘルスケア製品コード。：RPN303B）に転送する17。 HIS3遺伝子を含む1.8キロバイトのBamHI / BamHIでゲノムクローンに：ランダムプライミング（RPN1604。アマシャムバイオサイエンス製品コード）で得られた32 P -標識したプローブとハイブリダイズする。 オートラジオグラフィーまたはphosphorimagingによってDNA断片を可視化する。 4。で分離された染色体を用いて染色体のブロット分析輪郭クランプ均一な電場（CHEFを）： アガロースプラグ18の選択された彼の+の組換え体から染色体を準備します。 彼+候補TXVの液体培養を拡大：：IIIの約1〜2 × 10 8細胞/ mlにYPD 5mlに組換え染色体を含有する。 スピンダウンし、50mMのEDTAで細胞を2回洗浄する。 ℃の50mMのEDTAの約200μlに懸濁し、そして50〜暖かい低融点アガロースを50℃まで、徹底的にミックスを持って来た2溶融％の等量（W / V）を追加します。 プラグの型に約80μlを分注し、それらは4で30分間冷却することができます℃まで押し出しは、12ウェルディッシュに金型からプラグ。最大5つのプラグには、各ウェルに配置することができます。 各ウェルに、新たに調製したspheroplastingソリューションを3 ml（14 mMの2 – β-メルカプトエタノール、20mMのEDTA、0.5 mg / mlのザイモリアーゼ20T、10mMトリス- HCl、pHを7.5、1 Mソルビトール）を追加します。 ℃で4時間穏やかに撹拌しながら37℃でインキュベートする。 spheroplasting溶液を除去し、LDS溶液（10mMトリス- HCl、pH8.0の、100mMのEDTA、1％（w / v）のドデシル硫酸リチウム、adjus 3mlで置き換える8.0へのtのpHは）。 37℃で穏やかに振とうさせながら15分間インキュベートする。 LDSの溶液を除去し、LDSの別の3 mlのアリコートと交換してください。穏やかに撹拌しながら37℃で一晩インキュベートする。 LDSを取り外し、0.2 X NDS（0.6グラムトリスベース、93グラム二ナトリウムEDTA二水和物、5gのN -ラウロイルサルコシン、pHを8.0に調整し、のdH 2 Oで500 mlにもたらした）3mlで置き換えます。おだやかに振とうしながら30分間室温でインキュベートする。 NDSを削除し、2回を繰り返します。 NDSを削除し、3ミリリットルのTEと交換してください。室温で30分間穏やかに撹拌しながら洗浄する。 4回繰り返します。 店は4でプラグ° C TE 2溶液に加えた。プラグは1年間は保つことができる。 14でBio – RadのCHEF – DRIIの装置を使用して1％アガロースゲル上で別々の染色体° C（カタログ番号：170〜3612）。 パラメータ：第1ブロック ：70のスイッチの時、6V/cmで15時間。 第2ブロック：120秒のスイッチ時間、6V/cmで11H UV Stratalinker（Stratagene社製）で紫外線の60ミリジュールで照射し、30分間1μg/mlのエチジウムブロマイド染色により染色体を可視化する、とのdH 2 O中で30分間脱染色メンブレンへの効率的な転送を可能にするためにエチジウムブロマイド染色した染色体のニックのDNAを照射する。 変性条件下での毛管現象（0.4NのNaOH、1.5M NaCl）中で：正に帯電した膜（RPN303B。ハイボンドN +、GEヘルスケア製品コード）に染色体を転送する。 HIS3遺伝子17を含む1.8キロバイトのBamHI / BamHIでゲノムのクローンで：ランダムプライミング（RPN1604。アマシャムバイオサイエンス製品コード）で得られた32 P -標識したプローブとハイブリダイズする。 オートラジオグラフィーまたはphosphorimagingによって染色体を可視化する。 5。代表的な結果： 転座アッセイのグラフィカルな表現は、染色体レベル（ 図1）で描かれている。実験手順の概略は、（ 図2A）が表示されます。両方の事前と事後誘導メッキ効率は血球計数（ 図4B）によって決定される培養中の細胞体の合計数で実行可能な、コロニー形成細胞の総数で割ることにより決定されています。事前事後誘導メッキ効率は野生型細胞（p値= 0.1400）（ 表1）に対しては有意差はなかった。 表1。プレと野生型細胞で誘導後メッキ効率。 ミリリットル当たりの細胞体の数は、血球計算盤の数によって決定されます。 Bミリリットル当たり生存細胞の数は〜100から200コロニーを生成するために、非選択培地上に適切な希釈物をメッキすることによって決定されています。 C前後の誘導メッキ効率は血球計算盤の数によって決定された培養における細胞体、の合計数で実行可能な、コロニーが形成、細胞の総数で割ることにより決定されています。 これは、転座染色体の有無は、DSBの形成を生き残る能力に影響しないことを示唆している。染色体転座の頻度は、YPD上にメッキ（ 図2B）によって決定される生細胞数の合計でヒスチジン原栄養のコロニーの数で除して算出することができます。 （ – / -すなわちrad51Δ）このアッセイは、タンパク質機能の損失がSSAにどのように影響するかを識別するために、異なる遺伝子型の菌株を用いて行うことができる。異なる株で決定した組換えの頻度は、（ 図2C）SSAによるHOエンドヌクレアーゼ誘発DSBのを修復するためにこれらの株の能力の差を比較するためにグラフ化することができます。転周波数が選択的に得ながら、選択の下で野生型二倍体株（2.2×10 -2）と条件（2.17×10 -2）、非選択的に得られる転座の頻度は、（p値= 0.9131）は互いに統計的に差はなかったrad51Δ付き（6.0×10 -2）と非選択的（11.9×10 -2） – / -ホモ接合体は似ていますが（p値= 0.0089）、統計的に異なっていた。 RAD51との両方を選択的に（p値= 0.0001）と非選択的に（p値= 0.0002）が得られる周波数° – / -ホモ接合体は野生型株と対応する条件を用いて得られたものから統計的に異なっていた。 推定される転座ベアリングクローンをさらにゲノムサザンブロット及び染色体ブロット解析（ 図3）によって調べることができます。サザン分析のために、ゲノムDNAは32にブロッティングし、ハイブリダイゼーション、前にアガロースゲル電気泳動へのBamHIエンドヌクレアーゼで消化され診断0.8キロバイトhis3Δ200を可視化するためにP -標識1.8キロバイトHIS3プローブ、1.7キロバイトHIS3 -Δ3"、4キロバイトtIII：：XV、5 KB TXV：：III、および8キロバイトHIS3 -Δ5'フラグメント（ 図3B.1） 。無傷の染色体を調製し、CHEF（ 図3B.2）で区切られ、ナイロンにブロットし、染色体XV、0.8 MB TXV無傷1.1 MB可視化するために32 P -標識1.8キロバイトHIS3プローブとハイブリダイズすることができます：IIIの転座染色体、0.6 MBをtIII：XVの転座染色体、および0.3 MB無傷の染色体III（ 図3B.3）。グラフィカルなマップを、BamHIエンドヌクレアーゼ消化ゲノムDNA断片を期待し、親と組換え染色体、（ 図3A）描かれて描いた。 図1。アニーリング一本鎖（SSA）によって転座染色体の形成。1）DSBはは、文化へのガラクトースの添加後HOエンドヌクレアーゼによりHIS3 -Δ3"とHIS3 -Δ5"基質（染色体XVとIII、それぞれ）で作成されます。 2）DSBはが壊れた染色体の末端に3'一本鎖を生成するために処理されます。 3）SSA機械のアニール、相補311または組換えの基板のそれぞれに形成された60ヌクレオチドの一本鎖HIS3シーケンス。非相同焼鈍時に形成された尾は、エンドヌクレアーゼ消化によって除去されています。 HOエンドヌクレアーゼ消化により形成された残りの染色体断片上の相補的four bpのオーバーハングもアニールすることがあります。 SSAによるIIIの転座染色体：：4）ライゲーションはそのままHIS3遺伝子とTXVの作成 ​​を終了します。この染色体を持つ細胞は、培地欠けているヒスチジンに増殖する能力によって選択することができます。 ：NHEJのようなメカニズムにより、XVの転座染色体：ライゲーションには、相互tIIIを生成することがあります。 図2。 SSAで転座の頻度を決定するためのアッセイ。）1mlをYPGly /ラック文化がセレクト遺伝子型の細胞の単一コロニーを接種し、約5 × 10 7 × 10 8細胞/ mlの適切な密度に栽培されている。ガラクトースは、染色体IIIとXVでの再結合の基質でDSBのを作成するには、2％の最終濃度に追加されます。選択的な条件の下でアッセイを行うために、適切な希釈液を約100〜200細胞をYPDに蒔きされるように作られ、細胞が十分な数の彼の+組換えコロニーの観察数を得るために培地欠けヒスチジン上にプレーティングされています。選択なしでアッセイを行うために、約100〜200細胞が、YPD上に播種培地欠けているヒスチジンに蒔き、単一のコロニーと、レプリカに2〜3日間栽培されている。 B）転座の頻度は、YPD上で成長率によって上、彼のプレートに成長したコロニーの数で割ることにより決定することができます。 C）異なる遺伝子型（ すなわち、野生型とrad51Δの株の転座の頻度は、 – / – ）SSAによるDSBのを修復するためにこれらの株の能力の差を比較するためにグラフ化することができます。 図3。メッキの効率を決定する。（A）細胞のアリコートを一晩前に文化やポストDSBの誘導から取られ、適切な希釈液は、培養のmlあたり細胞体の合計数を決定するために血球計カウントに続いて、作られています。適切な希釈液をYPDに表示されるコロニーを計数することにより、mLあたりの生細胞の総数を決定するために、非選択培地上にプレーティングされています。 （B）メッキの効率は、細胞体の合計数によって生存細胞の合計数を割って、100でこの商を乗じて決定されます。 図4。ゲノムサザンブロットおよび染色体のブロット分析により、染色体転座のイベントの検出。 A）の前（左）と転座の形成（右）の後に関連する染色体のグラフィカルな表現が。 親と組換え体のサイズがメガベース-ペア（MB）に記載されています。親と組換え株からゲノムDNAのBamHI消化によって生成された、関連する配列を含む制限酵素断片のサイズ、および1.8 kbのBamHI HIS3ゲノムクローンとのハイブリダイゼーションによりブロットで明らかになったが、キロベースペア（KB）に記載されています。染色体は、正寸ではありません。 B）の推定転座-ベアリングクローンの物理的な分析を。 （1）ゲノムサザンブロット解析を – ゲノムDNAは、BLO、ゲル電気泳動にて分画し、BamHI制限エンドヌクレアーゼで収集し、消化し、ナイロンにtted、および以下の断片を可視化するために32 P -標識1.8キロバイトHIS3プローブにハイブリダイズ：0.8キロバイトhis3Δ200、1.7キロバイトHIS3 -Δ3を"、4キロバイトtIII：：XV、5 KB TXV：：III、および8キロバイトHIS3 -Δ5"。レーン：）親の二倍体、b）の組換えHis +非相互転座、C）彼の+相互転座の組換え。 （2）CHEFゲル – 無傷の染色体は、エチジウムブロマイドで染色し、紫外線下で可視化、CHEFで区切られた、アガロースプラグに調製した。レーン：上記のように。 （3）染色体のブロット-分離された染色体はナイロンにブロットし、以下の染色体可視化するために32 P -標識1.8キロバイトHIS3プローブとハイブリダイズさせた：1.1 MB無傷の染色体XV、0.8 MB TXV：IIIの転座染色体、0.6 MB tIII：XVの転座を染色体、および0.3 MB無傷の染色体III。レーン：上記のように。