Kwantificering en analyse van de vorming van HO-endonuclease chromosomale translocaties Gestimuleerd door Single-Strand Gloeien in Saccharomyces cerevisiae</em

1. HO-gestimuleerde translocatie frequenties Inoculeren 10-20 onafhankelijke 1 ml culturen van YPGly / Lac medium (1% gistextract, 2% pepton, 3% glycerol en 3% lactaat) met een enkele kolonies van het gewenste genotype. Incubeer de culturen 's nachts, of voor voldoende tijd om een cel dichtheid van ongeveer 5×10 1×10 7-8 cellen / ml te bereiken, bij 30 ° C op een rotator, of onder zacht schudden. Voeg galactose aan de culturen tot een uiteindelijke concentratie van 2% tot HO-endonuclease-gericht DSB's te induceren bij de his3-Δ3 '(chromosoom III) en his3-Δ5' (chromosoom XV) translocatie substraten. Incubeer gedurende 4 uur bij 30 ° C op een rotator, of onder zacht schudden. Na 4 uur, plaat van geschikte verdunningen van de culturen op YPD (1% gistextract, 2% pepton, 2% dextrose) naar ongeveer 100 tot 200 kolonies per plaat, en een voldoende aantal cellen op medium zonder histidine geven aan een waarneembare opbrengst het aantal van Zijn + recombinant kolonies. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende twee tot drie dagen. LET OP: Stap 1.4 beschrijft de bepaling van de translocatie frequenties onder selectieve condities door uitplating de culturen op medium zonder histidine. Deze test kan ook worden uitgevoerd onder niet-selectieve omstandigheden door uitplating culturen op YPD, en vervolgens replica-plating de kolonies die zich voordoen op-Zijn platen twee tot drie dagen later. Deze methoden tot vergelijkbare frequenties van translocatie (figuur 2C). Bepaal de translocatie frequentie door het aantal van histidine prototrofe kolonies door het totaal aantal plated levensvatbare cellen (bepaald door uitplating verdunningen op YPD). Bepaal de mediaan translocatie frequentie en de 95%-betrouwbaarheidsinterval 15. 2. Plating efficiëntie Verwijder een aliquot van cellen van elkaar 's nachts cultuur, en bepaal het aantal cellen door hemacytometer count (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1). Plaat ongeveer 100 tot 200 cellen met behulp van een geschikte verdunning op YPD. Incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 30 ° C (bijvoorbeeld voor een cultuur met een cel dichtheid van 1×10 8 cellen / ml, moet men plaat 100-200 ul van een 10-5 verwatering per plaat). Voeg 20% ​​galactose om de culturen tot een uiteindelijke concentratie van 2%. Na 4 uur, verwijderen van een hoeveelheid cellen van elke cultuur, bepalen het aantal cellen door hemacytometer tellen, en de plaat ongeveer 100 tot 200 cellen met behulp van een geschikte verdunning op YPD. Incubeer gedurende twee tot drie dagen bij 30 ° C. Bepaal de plating efficiëntie door het aantal kolonies die op YPD door het aantal cellen geplateerd, en vermenigvuldigen dit quotiënt met 100. Bepaal de mediaan percentage met een betrouwbaarheidsinterval van 95%. 3. Genomische Southern blot-analyse Selecteer een Zijn + recombinant kolonie van elke onafhankelijke studie en voor te bereiden genomisch DNA 16. Digest ongeveer 4 ug van DNA met BamHI restrictie-endonuclease. Aparte BamHI verkregen fragmenten op een 0,7% agarose gel, en over te dragen aan een positief geladen nylon membraan (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) 17. Hybridiseren met een 32 P-gelabelde probe verkregen door een willekeurige priming (Amersham Biosciences Product Code:. RPN1604) met een 1,8 kb BamHI / BamHI genomische kloon die het HIS3 gen. Visualiseer DNA-fragmenten door autoradiografie of phosphorimaging. 4. Chromosoom blot analyse met behulp van chromosomen gescheiden in een contour-geklemde homogeen elektrisch veld (CHEF): Bereid chromosomen van geselecteerde Zijn + recombinanten in agarose pluggen 18: Grow een vloeibare cultuur van het Zijn + kandidaat TXV:: III chromosoom-bevattende recombinant in 5 ml YPD tot ongeveer 1-2 x 10 8 cell / ml. Spin down en was de cellen twee keer met 50 mM EDTA. Resuspendeer cellen in ongeveer 200 ul van 50 mM EDTA, en warm tot 50 ° C. Voeg een gelijk volume van gesmolten 2% (w / v) low melt agarose gebracht tot 50 ° C, meng zorgvuldig. Verdeel ongeveer 80 ul fracties in de stekker mallen, en laat ze gedurende 30 minuten afkoelen bij 4 ° C. Extrude stekkers uit de mal in een 12-well schotel. Tot vijf pluggen kunnen worden geplaatst in elk putje. Voeg 3 ml vers bereide spheroplasting oplossing (14 mM 2-β-mercapto-ethanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M sorbitol) aan elk putje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur onder zacht schudden. Verwijder spheroplasting oplossing en te vervangen door 3 ml van LDS-oplossing (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) Lithium dodecylsulfaat, verstelbaart pH tot 8,0). Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten onder zacht schudden. Verwijder de LDS oplossing en vervangen door een andere 3 ml van LDS. Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht onder zacht schudden. Verwijder de LDS en te vervangen door 3 ml van 0,2 X NDS (0,6 g Tris Base, 93 g dinatrium EDTA Dihydraat, 5 g N-Lauroyl sarcosine, breng de pH op 8,0, gebracht tot 500 ml met dH 2 O). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten onder zacht schudden. Verwijder de NDS, en herhaal twee keer. Verwijder de NDS en te vervangen door 3 ml TE. Wassen met zacht schudden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit 4 keer. Bewaar stekkers bij 4 ° C in 2 ml van TE. Pluggen kunnen houden tot een jaar. Aparte chromosomen op een 1% agarosegel met behulp van een Bio-Rad CHEF-DRII apparaat bij 14 ° C (Catalog #: 170 tot 3.612). Parameters: 1 ste Blok: 70s tijd instellen, 15u op 6V/cm. 2 e Vak: 120s tijd instellen, 11u op 6V/cm Visualiseer chromosomen door kleuring met ethidiumbromide 1μg/ml gedurende 30 min, bestraling met 60 mJ van UV in een UV-Stratalinker (Stratagene), en de-kleuring voor 30 min in dH 2 O. Bestralen ethidiumbromide gekleurde chromosomen inkepingen van de DNA te zorgen voor efficiënte overdracht aan het membraan. Overdracht chromosomen van een positief geladen membraan (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) door capillaire werking in denaturerende omstandigheden (0.4N NaOH, 1.5M NaCl). Hybridiseren met een 32 P-gelabelde probe verkregen door een willekeurige priming (Amersham Biosciences Product Code:. RPN1604) met een 1,8 kb BamHI / BamHI genomische kloon die het HIS3-gen 17. Visualiseer chromosomen door autoradiografie of phosphorimaging. 5. Representatieve resultaten: Een grafische weergave van de translocatie test is afgebeeld op het chromosomaal niveau (figuur 1). Een schema van de experimentele procedure wordt ook weergegeven (Figuur 2A). Zowel de pre-en post-inductie plating rendementen worden bepaald door het totaal aantal levensvatbare, kolonievormende cellen door het totaal aantal cellichamen in de cultuur wordt bepaald door hemacytometer count (Figuur 4B). Pre-en post-inductie plating efficiënties waren niet significant verschillend voor wild-type cellen (p-waarde = 0,1400) (Tabel 1). Tabel 1. Pre-en post-inductie plating efficiëntie in wild-type cellen. een Het aantal cellichamen per milliliter worden bepaald door hemacytometer tellen. b Het aantal levensvatbare cellen per milliliter worden bepaald door plating van geschikte verdunningen op niet-selectief medium tot ~ 100 tot 200 kolonies te produceren. c De pre-en post-inductie plating rendementen worden bepaald door het totaal aantal levensvatbare, kolonievormende, cellen door het totaal aantal cellichamen in de cultuur, bepaald door hemacytometer tellen. Dit suggereert dat de aanwezigheid of afwezigheid van een van beide translocatie chromosoom geen invloed heeft op het vermogen om te DSB formatie te overleven. De frequentie van chromosomale translocaties kan worden berekend door het aantal histidine prototrofe kolonies door het totaal aantal levensvatbare cellen bepaald door uitplating op YPD (Figuur 2B). Deze test kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende stammen van genotype te bepalen hoe het verlies van eiwit functie van invloed op SSA (rad51Δ ie – / -). Recombinatie-frequenties bepaald in verschillende stammen kan dan worden getekend om de verschillen in het vermogen van deze stammen voor de HO-endonuclease veroorzaakt DSB's te repareren door SSA (figuur 2C) te vergelijken. Translocatie frequenties verkregen met het wild-type diploïde stam onder selectieve (2.2×10 -2) en niet-selectieve (2.17×10 -2) omstandigheden waren niet statistisch significant verschillend van elkaar (p-waarde = 0,9131), terwijl de translocatie frequenties verkregen selectief (6.0×10 -2) en niet-selectief (11.9×10 -2) met de rad51Δ – / – homozygoot waren gelijk, maar statistisch verschillend (p-waarde = 0,0089). De frequenties die verkregen zijn zowel selectief (p-waarde = 0,0001) en niet-selectief (p-waarde = 0,0002) met de RAD51 ° – / – homozygoot waren statistisch significant verschillend van verkregen die gebruik maken van de daarbij gestelde voorwaarden met het wild-type stam. Vermoedelijke translocatie-dragende klonen kunnen verder worden onderzocht door genomische Southern blot en chromosomale blot analyses (figuur 3). Voor Zuid-analyse wordt genomisch DNA geknipt met BamHI endonuclease voorafgaand aan de agarosegel elektroforese, blotting en hybridisatie met een 32P-gelabelde 1.8kb HIS3 sonde naar de diagnostische 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, en 8 kb his3-Δ5' visualiseren fragmenten (figuur 3B.1) . Intact chromosomen kunnen worden bereid, gescheiden door chef-kok (figuur 3B.2), uitgewist met nylon en gehybridiseerd met de 32 P-gelabelde 1,8 kb HIS3 sonde naar 1,1 Mb intact chromosoom XV, 0,8 Mb TXV visualiseren: III translocatie chromosoom, 0,6 Mb tIII: XV translocatie chromosoom, en 0,3 Mb intact chromosoom III (figuur 3B.3). Een grafische kaart afgebeeld verwacht BamHI endonuclease-verteerd genomische DNA-fragmenten, en ouder en recombinant chromosomen, is afgebeeld (Figuur 3A). Figuur 1. De vorming van translocatie chromosomen door de single-streng gloeien (SSA). 1) DSB's zijn gemaakt op de his3-Δ3 'en his3-Δ5' substraten (chromosomen XV en III, respectievelijk) door HO endonuclease na toevoeging van galactose aan de culturen. 2) DSB's zijn verwerkt tot drie 'single-strengen te genereren aan de uiteinden van de chromosomen. 3) SSA machines anneals complementaire 311 of 60 nucleotide enkelstrengs HIS3 sequenties gevormd bij elk van de recombinatie substraten. Niet-homologe staarten gevormd na uitgloeien worden verwijderd door endonuclease spijsvertering. Aanvullende vier bp overhangen op de resterende chromosomale fragmenten gevormd door HO-endonuclease spijsvertering kan ook gloeien. 4) Ligatie sluit de oprichting van een intacte HIS3-gen en TXV:: III translocatie chromosoom door SSA. Cellen die dit chromosoom kan worden geselecteerd door hun vermogen om te groeien op medium zonder histidine. Ligatie kan ook leiden tot de wederzijdse tIII:: XV translocatie chromosoom door een NHEJ-achtige mechanisme. Figuur 2. Test voor het bepalen van de frequentie van de translocatie van SSA. A) Een ml YPGly / Lac culturen worden geënt met enkele kolonies van cellen van een select genotype en uitgegroeid tot een geschikte dichtheid van ongeveer 5×10 1×10 7-8 cellen / ml. Galactose wordt toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 2% tot DSB's te creëren op de recombinatie substraten op chromosomen III en XV. Voor het uitvoeren van de test onder selectieve condities, geschikt zijn verdunningen gemaakt zodanig dat ongeveer 100 tot 200 cellen worden uitgeplaat op YPD en een voldoende aantal cellen worden uitgeplaat op medium zonder histidine om een waarneembare aantal van Zijn + recombinant kolonies opleveren. Voor het uitvoeren van de test zonder selectie, zijn ongeveer 100 tot 200 cellen uitgeplaat op YPD, geteeld voor twee tot drie dagen aan enkele kolonies en vervolgens replica uitgeplaat op medium zonder histidine. B) translocatie frequentie kan worden bepaald door het aantal kolonies dat on-Zijn platen groeien door de fractie die groeien op YPD. C) De translocatie frequenties van de verschillende stammen van genotype (dat wil zeggen wild-type en rad51Δ – / -) kan worden getekend om de verschillen in het vermogen van deze stammen aan de DSB's te repareren door SSA vergelijken. Figuur 3. Het bepalen van plating efficiëntie. (A) Een deel van de cellen is ontleend aan de 's nachts cultuur voorafgaand aan en na de DSB inductie, geschikt zijn verdunningen gemaakt, gevolgd door een hemacytometer tellen tot het totaal aantal cellichamen per ml van de cultuur te bepalen. Van geschikte verdunningen zijn uitgeplaat op niet-selectief medium om het totale aantal levensvatbare cellen per ml te bepalen, door het tellen van de kolonies die op YPD. (B) De beplating rendement wordt dan bepaald door het totaal aantal levensvatbare cellen door het totaal aantal van de cellichamen, en vermenigvuldigen dit quotiënt met 100. Figuur 4. Detectie van chromosomale translocatie evenementen door genomische Southern blot en chromosoom blot analyses. A) Grafische weergave van relevante chromosomen voor (links) en na (rechts) translocatie formatie. Afmetingen van ouder en recombinant chromosomen worden in megabase-paren (Mb). Maten van restrictiefragmenten met relevante sequenties gegenereerd door BamHI digestie van genomisch DNA van ouder-en recombinante stammen, en onthulde op de blots door hybridisatie met een 1,8 kb BamHI HIS3 genomische kloon, zijn weergegeven in kilobase-paren (kb). Chromosomen zijn niet op schaal getekend. B) Fysische analyse van de vermeende translocatie-dragende klonen. (1) Genomic Southern-blot-analyse – Genomic DNA werd verzameld en gedigereerd met BamHI restrictie-endonuclease, gefractioneerd door gelelektroforese, bloTTED tot nylon, en gehybridiseerd met een 32 P-gelabelde 1,8 kb HIS3 sonde naar de volgende fragmenten te visualiseren: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tIII:: XV, 5 kb TXV:: III, en 8 kb his3-Δ5 '. Lanes: een) ouder diploïde, b) Zijn + niet-wederzijdse translocatie recombinant, c) Zijn + wederzijdse translocatie recombinant. (2) CHEF gels – Intact chromosomen werden voorbereid in agarose pluggen, gescheiden door chef-kok, gekleurd met ethidiumbromide en zichtbaar onder UV-licht. Lanes: Zoals hierboven. (3) Chromosoom blots – Gescheiden chromosomen uitgewist om nylon en gehybridiseerd met de 32 P-gelabelde 1,8 kb HIS3 sonde naar de volgende chromosomen te visualiseren: 1.1 Mb intact chromosoom XV, 0,8 Mb TXV: III translocatie chromosoom, 0,6 Mb tIII: XV translocatie chromosoom, en 0,3 Mb intact chromosoom III. Lanes: Zoals hierboven.