HO-Endonuclease Oluşum kantitasyonu ve Analiz Tavlama Tek-Strand kromozomal Translokasyonlar Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

1. HO-uyarılmış translokasyon frekansları Istenilen genotip tek koloniler YPGly / Lac orta (% 1 maya özü,% 2 pepton,% 3 gliserol ve% 3 laktat) 10-20 bağımsız 1 ml kültürleri inoküle edin. 30 ° C rotator, ya da yavaşça sallanarak, yaklaşık 5×10 7-1×10 8 hücre / ml bir hücre yoğunluğu ulaşmak için yeterli bir süre için, bir gecede veya kültürler inkübe edin . His3 Δ3 '(kromozom III) ve his3 Δ5' (kromozom XV) translokasyon substratlar HO endonükleaz-yönettiği DSBs ikna etmek için son konsantrasyonu% 2 kültürlere galaktoz ekle. 4 saat boyunca inkübe 30 ° C rotator veya yavaşça sallanarak. 4 saat sonra, uygun dilüsyonları YPD üzerine kültürleri (% 1 maya özü,% 2 pepton, 2% dekstroz) plaka gözlemlenebilir verim yaklaşık 100 ila 200 plaka başına koloniler ve hücrelerin yeterli sayıda orta eksik histidin üzerine verim Onun + rekombinant kolonilerin sayısı. 30 plaka inkübe ° C'de 2-3 gün. NOT: Adım 1.4 orta eksik histidin üzerine kültürler kaplama translokasyon frekanslarının belirlenmesi seçici koşullar altında açıklanmıştır. Bu testte de 2-3 gün sonra tabak-Onun üzerine ortaya çıkan koloniler sonra çoğaltma kaplama kaplama kültürleri üzerine YPD seçici olmayan koşullar altında yapılan ve olabilir. Bu yöntemler translokasyon benzer frekansları (Şekil 2C) üretir. Kaplama canlı hücrelerinin toplam sayısı (YPD kaplama dilüsyonları tarafından belirlenir) histidin prototrophic kolonilerin sayısı bölerek translokasyon sıklığını belirlemek. Medyan translokasyon sıklığı ve% 95 güven aralığı 15 belirleyin. 2. Kaplama verimliliği Her gecede kültür hücreleri bir kısım çıkarın ve hemasitometre sayımı (Baxter Healthcare Corporation Katalog #: B3178-1) hücre sayısını belirlemek. Plaka yaklaşık 100 200 hücre YPD üzerine uygun bir seyreltme kullanarak. 2-3 gün boyunca 30 ° C'de (örneğin, bir hücre yoğunluğu 1×10 8 hücre / ml ile bir kültür, bir plaka, plaka başına 10-5 seyreltme ul 100-200) . ,% 2 final konsantrasyon kültürleri ila% 20 galaktoz ekleyin. 4 saat sonra, her kültürden bir kısım hücreler kaldırmak hemasitometre sayısına göre hücre sayısını belirlemek ve YPD üzerine uygun bir seyreltme plaka yaklaşık 100 ila 200 hücre. 2-3 gün süreyle inkübe 30 ° C. YPD kaplama hücrelerinin sayısına göre görünen ve 100 ile bu katsayı ile çarpımı kolonilerin sayısı bölerek kaplama etkinliğini belirlemek. % 95 güven aralığı ile medyan yüzdesi belirleyin. 3. Genomik Southern blot analizi Her bir bağımsız deneme bir tek Onun + rekombinant koloni seçin ve genomik DNA 16 hazırlamak. BamHI kısıtlama endonükleaz ile DNA yaklaşık 4 mg Digest. Ayrı BamHI% 0.7 agaroz jel üzerinde parçaları sindirilir ve pozitif yüklü bir naylon membran (Hybond N +, GE Healthcare Ürün Kodu: RPN303B) transfer 17 . HIS3 gen içeren 1.8 kb BamHI / BamHI genomik klon: random priming (RPN1604 Amersham Biosciences Ürün Kodu) tarafından elde edilen 32 P-işaretli prob ile melezleşme. Otoradyografi veya phosphorimaging DNA parçaları gözünüzde canlandırın. 4. Kromozom blot analizi ayrılmış kromozom kullanılarak bir kontur kenetli homojen elektrik alan (CHEF): Agaroz fişler 18 seçilen Onun + rekombinantlar kromozom hazırlayın: + Aday tXV bir sıvı kültür büyütün: III yaklaşık 1-2 x YPD 5 ml rekombinant kromozom içeren 10 8 hücre / ml. Spin ve hücreler 50 mM EDTA ile 2 kez yıkayın. Süspanse edin hücreleri ve 50 mM EDTA yaklaşık 200 ul ° C – 50 sıcak Düşük erime agaroz 50 ° C, iyice karıştırın getirdi% 2 erimiş eşit hacmi (w / v) ekleyin. Fiş kalıplar içine yaklaşık 80 ul alikotları koyun ve onlara 4 30 dakika soğumasını bekleyin ° C. Extrude 12-iyi bir çanak içine kalıp takılır. En fazla beş fişler her bir kuyunun içine yerleştirilebilir. Her iyi 3 ml taze hazırlanmış spheroplasting çözüm (2 β-mercaptoethanol 14 mM, 20 mM EDTA, 0.5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M Sorbitol) ekleyin. Yavaşça sallanarak ile 37 ° C'de 4 saat inkübe edin. Spheroplasting çözüm çıkarın ve LDS çözümü (3 ml yerine 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA,% 1 (w / v) Lityum Dodesil Sülfat, adjus8.0 t pH). 37 ° C'de 15 dakika yavaşça sallanarak inkübe. LDS çözüm çıkarın ve 3 ml LDS başka bir kısım ile değiştirin. Yavaşça sallanarak ° C gecede 37 inkübe edin. LDS çıkarın ve 0,2 X NDS (0.6 g Tris Baz, 93 g disodyum EDTA Dihidrat, 5 g N-Lauroyl sarkozin, 8.0 pH ayarı dH 2 O ile 500 ml) 3 ml ile değiştirin. Yavaşça sallanarak 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. NDS çıkarın ve 2 kez tekrarlayın. NDS çıkarın ve 3 ml TE ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça sallanarak ile yıkayınız. 4 kez tekrarlayın. Mağaza 4 fişler ° C TE 2 ml. Fiş bir yıl kadar tutabilirsiniz. 14 yaşında bir Bio-Rad CHEF-DRII aparatı kullanarak% 1 agaroz jel üzerinde ayrı kromozom ° C (Katalog no: 170-3612). Parametreler: 1. Blok: 70s geçiş süresi 6V/cm az 15 saat. 2. Blok: 120s geçiş süresi, 6V/cm az 11h 30 dakika 1μg/ml etidyum bromür ile boyanarak UV Stratalinker (Stratagene) UV 60 mJ ile aydınlatarak, kromozom görselleştirmek, ve 30 dakika dH 2 O için de boyama Membran verimli transferi için izin etidyum bromür boyanmış kromozom nickler DNA aydınlatarak. Denatüre koşulları kılcal eylem (0.4N NaOH, 1,5 M NaCl) pozitif yüklü bir membran (RPN303B. Hybond N +, GE Healthcare Ürün Kodu) kromozom aktarın. HIS3 gen 17 içeren bir 1.8 kb BamHI / BamHI genomik klon: random priming (RPN1604 Amersham Biosciences Ürün Kodu) tarafından elde edilen 32 P-işaretli prob ile melezleşme. Otoradyografi veya phosphorimaging kromozom gözünüzde canlandırın. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Translokasyon testinin grafiksel gösterimi kromozom (Şekil 1) tasvir edilmiştir. Deneysel işlemin şematik (Şekil 2A) görüntülenir. Her iki indüksiyon öncesi ve sonrası kaplama verimliliği yaşayabilir, koloni oluşturan hücrelerin hücre gövdeleri kültür hemasitometre sayımı (Şekil 4B) tarafından belirlenen toplam sayısı toplam sayısına bölünmesiyle belirlenir. Indüksiyon öncesi ve sonrası kaplama verimliliği yabani tip hücrelerin (p-değeri = 0,1400) (Tablo 1) anlamlı derecede farklı değildi. Tablo 1. Ön ve yabani tip hücrelerin sonrası indüksiyon kaplama verimliliği. hemasitometre sayısı mililitrede hücre gövdeleri bir numara tarafından belirlenir. b sayısı mililitrede canlı hücreler non-selektif ortam üzerine uygun seyreltiler kaplama ~ 100-200 koloniler tarafından belirlenir. c pre-ve post-indüksiyon kaplama verimleri toplam sayısına bölünmesiyle belirlenir yaşayabilir, koloni oluşturan, hemasitometre sayısı tarafından belirlenen hücre kültür kuruluşları, toplam sayısına göre hücreler. Bu yeteneği DSB oluşumu hayatta kalmak için her iki translokasyon kromozom varlığı ya da yokluğu etkilemez göstermektedir. Kromozomal translokasyonların frekans YPD üzerine kaplama (Şekil 2B) tarafından belirlenen toplam sayısına göre canlı hücreler histidin prototrophic kolonilerin sayısına bölünmesiyle hesaplanır. (- / – Yani rad51Δ) Bu testte protein fonksiyon kaybı SSA nasıl etkilediğini belirlemek için farklı genotip suşu kullanılarak yapılan olabilir. Farklı türlerin tespit Rekombinasyon frekansları sonra SSA (Şekil 2C) ve HO-endonükleaz indüklenen DSBs onarmak için bu suşların yeteneği farklılıkları karşılaştırmak için grafikle gösterilebilir. Translokasyon frekansları seçici seçici altında yabani tip diploid suşu (2.2×10 -2) ve koşulları (2.17×10 -2), non-selektif ile elde Translokasyon frekansları elde ederken, birbirlerinin (p-değeri = 0,9131) istatistiksel olarak farklı değildi (6.0×10 -2) ve non-seçici (11.9×10 -2) rad51Δ – / – homozigot benzer ancak istatistiksel olarak anlamlı fark vardı (p-değeri = 0,0089). / – Rad51 ° ile frekansları seçici hem de (p-değeri = 0.0001) ve seçici olmayan (p-değeri = 0.0002) elde edilen homozigot yabani tip suşu ile ilgili koşullar kullanılarak elde edilen istatistiksel olarak farklı idi. Olası translokasyon taşıyan klonların daha genomik Southern blot ve kromozomal leke analizleri (Şekil 3) tarafından incelenebilir. Güney analizi için, genomik DNA, agaroz jel elektroforezi önce BamHI endonükleaz ile 32 blot ve hibridizasyon sindirilirParçaları (Şekil 3B.1) 1.8kb HIS3 prob tanı 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ':: XV, 5 kb tXV: III, 8 kb his3-Δ5, 4 kb tIII görselleştirmek için P-etiketli . P-CHEF (Şekil 3B.2) ile ayrılmış, sağlam kromozomlar hazırlanan naylon için, lekelenen ve 32 melezleşmiştir olabilir etiketli 1,8 kb HIS3 prob görselleştirmek için 1.1 Mb sağlam kromozom XV, 0.8 Mb tXV: III translokasyon kromozom, 0.6 Mb tIII: XV translokasyon kromozom ve 0.3 Mb sağlam kromozom III (Şekil 3B.3). Bir grafik harita BamHI endonükleaz sindirilir genomik DNA parçaları, ve ebeveyn ve rekombinant kromozomlar, (Şekil 3A) tasvir edilmiştir bekleniyor tasvir. Şekil 1. Tek iplikli translokasyon kromozom Oluşumu (SSA) tavlama 1) DSBs kültürlere galaktoz Ayrıca aşağıdaki his3 Δ3 ve his3-Δ5 'yüzeyler (sırasıyla kromozom XV ve III) HO endonükleaz tarafından oluşturulur. 2) DSBs kırık kromozomların ucunda 3 'tek-ipliklerini oluşturmak için işlenir. 3) SSA makine tavlarıdır 311 tamamlayıcı veya rekombinasyon yüzeylerin her birinde oluşan 60 nükleotid tek telli HIS3 dizileri. Endonükleaz sindirim tavlama üzerine oluşmuş homolog olmayan kuyrukları tarafından kaldırılır. HO-endonükleaz sindirim oluşturduğu kalan kromozom parçaları üzerinde Tamamlayıcı dört bp çıkıntılar da tavlama. SSA tarafından III translokasyon kromozom: 4) ligasyon sağlam bir HIS3 gen ve tXV oluşturulması sonucuna varmıştır. Bu kromozom taşıyan hücreler orta eksik histidin büyümeye yeteneklerine göre seçilebilir. NHEJ-benzeri bir mekanizma ile XV translokasyon kromozom: ligasyonu da karşılıklı tIII oluşturabilir. Şekil 2. SSA tarafından translokasyon sıklığı belirlemek için Testi A) Bir ml YPGly / Lac kültürlerin seçkin bir genotip hücreleri tek koloniler ile aşılanmış ve yaklaşık 5×10 7-1×10 8 hücre / ml uygun bir yoğunluk büyüdü. Galaktoz, kromozomları III ve XV rekombinasyon substratlar DSBs oluşturmak için son konsantrasyonu% 2 eklenir. Seçici koşullar altında tahlil yapmak, uygun dilüsyonları yaklaşık 100 ila 200 hücre YPD üzerine kaplama olduğu gibi yapılır ve yeterli sayıda hücre Onun + rekombinant koloniler gözlemlenebilir bir verim orta eksik histidin üzerine kaplanmıştır. Seçim olmadan tahlil yapmak, yaklaşık 100 ila 200 hücre YPD üzerine kaplamalı orta yoksun histidin üzerine kaplama tek koloniler ve sonra çoğaltma 2-3 gün için yetiştirilir. B) Translokasyon frekans YPD yetişen fraksiyonu Onun plakalar büyüyecek kolonilerin sayısına bölünmesiyle belirlenir. C) farklı genotip (yani Wild-tip ve rad51Δ suşlarının translokasyon Frekanslar – / -) SSA DSBs onarmak için bu suşların yeteneği farklılıkları karşılaştırmak için grafikle gösterilebilir. Şekil 3. Kaplama verimliliği belirlenmesi. (A) hücrelerin bir kısım gecede önce kültür ve sonrası DSB indüksiyon alınır, uygun dilüsyonları kültür ml başına hücre gövdeleri toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre sayı ile takip yapılır. Uygun dilüsyonları YPD görünen koloniler sayma, canlı hücreler ml başına toplam sayısı belirlemek için non-selektif ortam üzerine kaplanmıştır. (B) kaplama verimliliği sonra canlı hücreleri hücre gövdeleri toplam sayısına göre toplam sayısına bölünmesiyle ve bu sayının 100 ile çarpılarak belirlenir. Şekil 4. Genomik Southern blot ve kromozom leke analizleri kromozomal translokasyon olayların tespiti. A) Grafik önce ilgili kromozom temsili (solda) ve (sağda) translokasyon oluşumundan sonra. Üst ve rekombinant kromozomlar Büyüklükleri megabase-çift (Mb) yer almaktadır. , Genomik DNA BamHI sindirim ebeveyn ve rekombinant suşlar tarafından oluşturulan ilgili dizilerini içeren kısıtlama parçalarının boyutları ve 1.8 kb BamHI HIS3 genomik klon hibridizasyon tarafından lekeler ortaya, kilobaz-çift (kb) yer almaktadır . Kromozomlar ölçekli çizilmiş değildir. B) Fiziksel varsayılan translokasyon taşıyan klonların analizi. (1) Genomik Southern blot analizi – Genomik DNA, jel elektroforezi, blo tarafından fraksiyone, BamHI restriksiyon endonükleaz ile toplanır ve sindirilmiş oldunaylon tted, aşağıdaki parçaları görselleştirmek için bir 32 P etiketli 1.8 kb HIS3 prob melezleşmiştir: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 ', 4 kb tIII: XV, 5 kb tXV: III ve 8 kb his3-Δ5 '. Lanes: rekombinant bir) ana diploid, b) Onun rekombinant + olmayan resiprokal translokasyon, c) Onun + karşılıklı translokasyon. (2) CHEF jeli – Bozulmamış kromozom etidyum bromür ile boyanmış, CHEF ayrılmış, agaroz fişleri hazırlanmış ve UV ışık altında görüntülendi. Lanes: Yukarıdaki gibi. (3) Kromozom leke – Ayrı kromozom naylon, lekelenen ve 32 P etiketli 1.8 kb HIS3 probu ile aşağıdaki kromozom görselleştirmek için melezleşmiştir: 1.1 Mb sağlam kromozom XV, 0.8 Mb tXV: III translokasyon kromozom, 0.6 Mb tIII: XV translokasyon kromozom ve 0.3 Mb sağlam kromozom III. Lanes: Yukarıdaki gibi.