Количественный и анализ формирования HO-эндонуклеаза Вынужденное Хромосомные транслокации по однонитевые Отжиг в Saccharomyces CEREVISIAE</em

1. HO-стимулированных частоты транслокаций Привить 10-20 независимых 1 мл культуры YPGly / Lac среде (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 3% глицерина и 3% лактата) с одной колонии желаемого генотипа. Инкубируйте культур на ночь, или на время, достаточное для достижения плотности клеток приблизительно 5×10 1×10 7-8 клеток / мл, при 30 ° С на поворотное устройство, или с нежным агитации. Добавить галактозы к культурам, чтобы конечная концентрация 2%, чтобы вызвать HO эндонуклеазы направленной на ДР his3-Δ3 (хромосома III) и his3-Δ5 '(хромосомы XV) транслокация субстратов. Инкубируйте в течение 4 часов при температуре 30 ° С на ротатор, или с нежным агитации. Через 4 часа, плиты соответствующего разведения культур на YPD (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 2% раствором декстрозы), чтобы получить примерно от 100 до 200 колоний на пластину, и достаточное количество клеток на среде гистидина не хватает для получения наблюдаемых число его + рекомбинантный колоний. Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение двух-трех дней. ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1,4 описывает определение транслокации частот при селективных условиях при посеве культур на среду отсутствуют гистидина. Этот анализ также может проводиться под неселективных условиях при посеве культур на YPD, а затем реплики-покрытие колоний, которые возникают на его пластинах-два-три дня позже. Эти методы дают аналогичные частоты транслокации (рис. 2С). Определить частоту перемещения путем деления числа колоний гистидина прототрофный на общее количество жизнеспособных клеток покрытием (определяется при посеве разведений на YPD). Определить среднюю частоту перемещения и 95% доверительный интервал 15. 2. Покрытие эффективности Удалить аликвоту клеток из каждой ночной культуры, и определить номер ячейки по hemacytometer счетчик (Baxter Healthcare корпорации Catolog #:. B3178-1). Пластина примерно от 100 до 200 ячеек с помощью соответствующего разбавления на YPD. Инкубируйте в течение двух-трех дней при температуре 30 ° C (например, для культуры плотности клеток 1×10 8 кл / мл, следует пластина 100-200 мкл разведения 10-5 на чашку). Добавить 20% галактозы к культурам до конечной концентрации 2%. Через 4 часа, удалить аликвоту клеток из каждой культуры, определить число клеток по hemacytometer считать, а плита примерно от 100 до 200 ячеек с помощью соответствующего разбавления на YPD. Инкубируйте в течение двух-трех дней при температуре 30 ° C. Определить эффективность покрытия путем деления числа колоний, появляющиеся на YPD по числу посеянных клеток и умножая этот фактор на 100. Определить средний процент с 95% доверительный интервал. 3. Геномная Южно-блот-анализа Выберите одну Его + рекомбинантный колонии от каждого независимого судебного разбирательства и подготовить геномной ДНК 16. Дайджест около 4 мкг ДНК с рестриктазой BamHI. Отдельные фрагменты BamHI усваивается на 0,7% агарозном геле, и трансфер в положительно заряженные нейлоновой мембраны (Hybond N +, GE Healthcare Код продукта:. RPN303B) 17. Скрещиваться с 32 Р-меченым зондом получить случайную грунтовки (Amersham Biosciences Код продукта:. RPN1604) с 1,8 кб BamHI / BamHI геномный клон, содержащий HIS3 гена. Визуализация фрагментов ДНК авторадиографией или phosphorimaging. 4. Хромосома блот анализа с использованием хромосомы разделены в контур-зажаты однородном электрическом поле (шеф-повар): Подготовка хромосомы от выбранного + Его рекомбинантов в пробки агарозном 18: Расти жидкости культуры Его + кандидата ТРВ:: III хромосоме содержащих рекомбинантный в 5 мл YPD примерно 1-2 х 10 8 клеток / мл. Спином вниз и промыть клетки 2 раза 50 мМ ЭДТА. Ресуспендируют клетки примерно в 200 мкл 50 мМ ЭДТА, и теплой до 50 ° C. Добавить равный объем расплавленного 2% (м / о) низкая расплава агарозном доведено до 50 ° С, тщательно перемешать. Внесите примерно 80 мкл аликвоты в разъем пресс-формы, и дать им остыть в течение 30 мин при 4 ° C. Extrude пробки из формы в 12-и блюдо. До пяти пробки могут быть помещены в каждую лунку. Добавьте 3 мл свежеприготовленного spheroplasting решение (14 мМ 2-β-меркаптоэтанола, 20 мМ ЭДТА, 0,5 мг / мл Zymolyase 20T, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 М сорбит) в каждую лунку. Инкубировать при 37 ° С в течение 4 часов с нежным агитации. Удалить spheroplasting решение и заменить 3 мл LDS решения (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ ЭДТА, 1% (м / о) литий додецилсульфата, adjusт рН до 8,0). Инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин при легком помешивании. Удалить LDS решение и заменить еще 3 мл аликвоту LDS. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи с нежным агитации. Удалить LDS и заменить с 3 мл 0,2 X NDS (0,6 г трис базы, 93 г динатрия ЭДТА дигидрат, 5 г N-лауроил саркозин, отрегулировать рН до 8,0, доведено до 500 мл с дН 2 O). Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин при легком помешивании. Удалить NDS, и повторить 2 раза. Удалить NDS и заменить 3 мл TE. Промыть легком помешивании в течение 30 мин при комнатной температуре. Повторить 4 раза. Магазин пробки при 4 ° С в 2 мл TE. Вилки могут держать на срок до года. Отдельные хромосом на 1% агарозном геле использованием Bio-Rad CHEF-DRII аппарата при 14 ° С (Catalog #: 170-3612). Параметры: 1-й блок: 70 реле времени, 15 ч при 6V/cm. 2-й блок: 120 с реле времени, 11h на 6V/cm Визуализируйте хромосом окрашиванием 1μg/ml бромистый этидий в течение 30 мин, облучение с 60 мДж ультрафиолетового в УФ Stratalinker (Stratagene), и де-окрашивания в течение 30 мин в дН 2 O. Облучение бромистый этидий окрашенных хромосом ники ДНК, чтобы обеспечить эффективную передачу к мембране. Передача хромосом к положительно заряженной мембраной (Hybond N +, GE Healthcare Код продукта:. RPN303B) под действием капиллярных сил в денатурирующих условиях (0.4N NaOH, 1,5 М NaCl). Скрещиваться с 32 Р-меченым зондом получить случайную грунтовки (Amersham Biosciences Код продукта:. RPN1604) с 1,8 кб BamHI / BamHI геномный клон, содержащий ген HIS3 17. Визуализируйте хромосом авторадиографией или phosphorimaging. 5. Представитель Результаты: Графическое представление анализа транслокации изображен на хромосомном уровне (рисунок 1). Схема экспериментальной процедуры также отображается (рис. 2А). И до и после индукции эффективность покрытия определяется путем деления общего числа жизнеспособных, колониеобразующих клеток общее количество клеточных тел в культуре определяется hemacytometer счет (рис. 4В). Пре-и пост-индукционной эффективность покрытия существенно не различались для дикого типа клеток (р-значение = 0,1400) (табл. 1). Таблица 1. Пре-и пост-индукции покрытие эффективности в дикого типа клеток. Число клеточных тел в миллилитре определяются hemacytometer счет. б количество жизнеспособных клеток на миллилитр определяются покрытие соответствующих разведений на неселективные среды для производства ~ 100-200 колоний. с пре-и пост-индукционной эффективность покрытия определяется путем деления общего числа жизнеспособных, формирования колонии, клетки на общее количество клеточных тел в культуре, определяется hemacytometer счет. Это говорит о том, что наличие или отсутствие либо транслокация хромосомы не влияет на способность к выживанию DSB образования. Частота хромосомных транслокаций могут быть рассчитаны путем деления числа колоний гистидина прототрофный на общее количество жизнеспособных клеток определяется при посеве на YPD (рис. 2В). Этот анализ может быть проведен с использованием штаммов различных генотипов чтобы определить, как потеря функции белка влияет SSA (т.е. rad51Δ – / -). Рекомбинация частот определяется в различные штаммы могут быть графически сравнить различия в способности этих штаммов для ремонта HO-эндонуклеазы индуцированных ДР по SSA (рис. 2С). Перемещение частоты, полученные с диким типом диплоидных деформации при селективной (2.2×10 -2) и неселективные (2.17×10 -2) условия не были статистически отличаются друг от друга (р-значение = 0,9131), а транслокации частоты, полученные выборочно (6.0×10 -2) и не выборочно (11.9×10 -2) с rad51Δ – / – гомозиготы были похожи, но статистически различными (р-значение = 0,0089). Частоты получены как выборочно (р-значение = 0,0001) и не выборочно (р-значение = 0,0002) с RAD51 ° – / – гомозиготы были статистически отличаются от тех, полученные с помощью соответствующих условий с штаммом дикого типа. Предполагаемые перемещение несущих клоны могут быть дополнительно рассмотрены геномной Южной пятно и хромосомные анализы пятно (рис. 3). Для Южной анализа, геномной ДНК переваривается с BamHI эндонуклеазы до электрофореза в агарозном геле, блоттинга и гибридизации с 32P-меченых 1.8kb HIS3 зонд для визуализации диагностических 0,8 кб his3Δ200, 1,7 кб his3-Δ3 ', 4 кб tIII:: XV, 5 кб ТРВ:: III, и 8 кб his3-Δ5 "фрагментов (рис. 3b.1) . Неповрежденная хромосом могут быть получены, разделенных CHEF (рис. 3b.2), уничтожены до нейлона и гибридизации с 32 Р-меченых 1,8 кб HIS3 зонд для визуализации 1.1 Mb нетронутыми хромосомы XV, 0,8 Mb ТРВ: III транслокация хромосомы, 0,6 Mb tIII: XV транслокация хромосомы, и 0,3 Mb нетронутыми хромосоме III (рис. 3b.3). Графическим изображением карты ожидается BamHI эндонуклеазы-переваренной геномной ДНК-фрагментов, а также родителей и рекомбинантных хромосом, изображен (рис. 3А). Рисунок 1. Формирование транслокации хромосом однонитевые отжига (SSA). 1) ДР создаются на his3-Δ3 и his3-Δ5 'субстратов (хромосом XV и III, соответственно) эндонуклеазой HO после добавления галактозы в культурах. 2) ДР обрабатываются для получения 3 'одной нити на концах хромосом сломанной. 3) SSA отжигов техники дополнительных 311 или 60 нуклеотидных одноцепочечной HIS3 последовательностей, сформированных в каждом из рекомбинации субстратов. Негомологичными хвосты, образующиеся при отжиге снимаются эндонуклеазой пищеварения. Дополнительные четыре б.п. свесы на оставшихся хромосомные фрагменты образована HO-эндонуклеазы пищеварения может также отжига. 4) Лигирование завершается создание нетронутыми HIS3 гена и ТРВ:: III транслокация хромосомы по SSA. Клетки проведения этой хромосомы могут быть выбраны для их способность расти на среде отсутствует гистидина. Лигирование может также привести к обратному tIII:: XV транслокация хромосомы от NHEJ-подобный механизм. Рисунок 2. Тест для определения частоты перемещения по SSA.) Один мл YPGly / Lac культурами засевают одной колонии клеток выберите генотипа и выросли до соответствующей плотности примерно 5×10 1×10 7-8 клеток / мл. Галактоза добавляется к конечной концентрации 2% для создания ДР на рекомбинацию субстратов на хромосомах III и XV. Для проведения анализа в селективных условиях, соответствующих разведений сделаны так, что приблизительно от 100 до 200 клеток высевали на YPD и достаточное количество клеток высевали на среду отсутствуют гистидина уступить наблюдаемым числом Его + рекомбинантных колоний. Для проведения анализа без отбора, примерно от 100 до 200 Клетки высевали на YPD, выращенные в течение двух-трех дней до одной колонии, а затем реплики высевали на среду отсутствуют гистидина. Б) транслокации частота может быть определена путем деления числа колоний, которые растут на его пластинах по доле, которые растут на YPD. С) транслокация частоты штаммов различных генотипов (т.е. дикого типа и rad51Δ – / -) можно графически сравнить различия в способности этих штаммов для ремонта ДР по SSA. Рисунок 3. Определение эффективности покрытия. () Аликвоту клеток, взятых из ночной культуры до и после DSB индукции, соответствующих разведений сделаны, а затем hemacytometer счет, чтобы определить общее количество клеточных тел на мл культуры. Соответствующие разведения высевают на неселективные среды, чтобы определить общее количество жизнеспособных клеток на миллилитр, путем подсчета колоний, которые появляются на YPD. (Б) покрытие эффективности в этом случае определяется путем деления общего числа жизнеспособных клеток общее количество клеточных тел, и этот фактор умножения на 100. Рисунок 4. Обнаружение хромосомных транслокаций событий по геномной Южной пятно и анализирует хромосомы пятно. ) Графическое представление соответствующих хромосом до (слева) и после (справа) транслокация образования. Размеры материнской и рекомбинантных хромосом перечислены в megabase-пар (Мб). Размеры рестрикционных фрагментов, содержащих соответствующие последовательности, порожденные BamHI переваривания геномной ДНК от родителей и рекомбинантных штаммов, и показал на пятна путем гибридизации с 1,8 кб BamHI HIS3 геномный клон, перечислены в kilobase-пар (кб). Хромосомы не в масштабе. Б) Физические анализ предполагаемого перемещения несущих клонов. (1) Геномная Южно-блот-анализ – Геномная ДНК была собрана и расщепляют рестриктазой BamHI, фракционированного помощью гель-электрофореза, Блоtted для нейлона и гибридизации с 32 Р-меченых 1,8 кб HIS3 зонд для визуализации следующие фрагменты: 0,8 кб his3Δ200, 1,7 кб his3-Δ3 ', 4 кб tIII:: XV, 5 кб ТРВ:: III, и 8 кб his3-Δ5. Дорожки:) родителя диплоидных, б) Его + невзаимных транслокации рекомбинантного, в) Его + взаимные транслокации рекомбинантного. (2) CHEF гели – неповрежденной хромосомы были подготовлены в пробки агарозы, разделенных CHEF, окрашивали бромистого этидия и визуализируется в УФ-свете. Дорожки: Как и выше. (3) Хромосомные пятна – Отдельные хромосомы были уничтожены до нейлона и гибридизации с 32 Р-меченых 1,8 кб HIS3 зонд для визуализации хромосом следующие: 1.1 Mb нетронутыми хромосомы XV, 0,8 Mb ТРВ: III транслокация хромосомы, 0,6 Mb tIII: XV транслокации хромосомы, и 0,3 Mb нетронутыми хромосоме III. Дорожки: Как и выше.