Mikroakışkan Aygıt compartmentalization E18 Kortikal Rat Nöronlar hazırlanması

Compartmentalization E18 Fetal Sıçan Kortikal nöronlar hazırlanması Başlamadan önce, gerekli tüm medya ve reaktifler 37 ° C'ye kadar ısıtmak için önemlidir. % 70 etanol ile silerek, kaput yerleştirilir hücreleri (örneğin, kauçuk ampuller, boru rafları, medya şişeleri, vb), ve hazırlanması için kullanılan her şeyi sterilize etmek için de önemlidir. E18 Fetal Sıçan Korteks iki adet (biri beyin, daha önce disseke) 1 ml buz Kalsiyum Magnezyum ücretsiz diseksiyonu tampon içeren 15 ml tüp yerleştirin. Son hacmi 2 ml ve% 0.125 'son tripsin konsantrasyon getirerek, diseksiyon tamponunda kortekse 1 ml% 0.25' lik tripsin-EDTA ekleyin. 8 dakika 37 ° C su banyosunda 15 ml tüp yerleştirin. Bu süre zarfında, yangın cilası 3 su bardağı Pasteur pipetler, kısırlık korumaya yardımcı olmak için bir biyogüvenlik kabini, gittikçe daha küçük açıklıklar oluşturan. Korteksin 8 dakika inkübasyondan sonra, DMEM korteks tripsin reaksiyon durdurmaya yardımcı olmak için% 10 FBS içeren 10 ml ekleyin. 2 dakika süreyle 2500 rpm'de korteks ve DMEM/10% FBS içeren 15 ml tüp santrifüjleyin. Biyogüvenlik kabini, vakum emme eklenmiş bir bardak yeniden süspanse kullanarak korteks süpernatant kaldırmak. Rahatsız ya da pelet çıkarmak için dikkatli olun. NMB 1 ml korteks pelet ve hafifçe pipetlemeyin yukarı ve aşağı ekleyin. Bu hava kabarcıkları oksidasyonu ile hücrelere zarar verebilir gibi, aşağı yukarı pipeting sırasında hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için çok önemlidir. Sonuna kadar steril bir kauçuk ampul takmak ve 5 kat yukarı ve aşağı pipeting korteks çiğnemek geniş açılması ile yangın cilalı yeniden süspanse kullanın, yine dikkatli olmak hava kabarcıkları tanıtmak değil. Her bir azalma açılış boyutu ile, diğer 2 cam pipetler ile bu işleme devam edin. Öğütme sonra 2 dakika süreyle 2500 rpm'de hücreleri tekrar santrifüj. Santrifüj sonra, bir kez daha süpernatantı kaldırmak ve NBM 2 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. 45 um hücre süzgecinden yeniden süspanse hücre çözümü Filtresi. Sayılır ve cihazlar içine yüklenen Tripan Mavi, hücrelerin Leke. Biz genellikle cihaz başına 20 ul hücrelerinin yükleyin. Not: hücrelerin nihai konsantrasyonu tipik olarak 2,5 milyon hücre / ml ve 8 milyon hücre / ml arasında Hücrelerin yükleniyor Hücreler sayılır edildikten sonra, cihaz hücreleri yük zamanı: Kısırlık korumak için biyogüvenlik kabini içine NBM içeren önceden hazırlanmış cihazlar getirin. Vakum emiş kuyularından aşırı ortamı çıkarın. Ancak, tüm medya kaldırarak önlemek için dikkatli olmak, ana kanal bazı medya olması gerekir. (Diyagram gerekirse bakınız) hücrelerin 20 ul cihazın sol üst rezervuar uygulayın. Hücreleri cihazın içine akışı ve PLL tedavi yüzey eklemek. Yükledikten sonra, bir kuluçka hücreleri takmak için izin vermek için 10 dakika geri hücreleri içeren cihazlar yerleştirmek. 10 dakika sonra geri inkübatör medya ve yer cihazlar rezervuarları doldurun.