Preparando E18 neurônios de rato para Cortical Compartimentação em um dispositivo micro

Preparando E18 neurônios de rato Fetal Cortical para Compartimentação Antes de começar, é importante para aquecer todos os meios necessários e reagentes para 37 ° C. Também é importante para esterilizar tudo o que é usado para preparar as células (por exemplo, lâmpadas de borracha, suportes de tubos, frascos de mídia, etc), e aquilo que é colocado na capa, limpando-se com etanol 70%. Coloque dois pedaços de E18 Cortex Rato Fetal (um cérebro, previamente dissecado) em um tubo de 15 ml contendo 1 ml gelada de cálcio sem magnésio livre de buffer de dissecção. Adicionar 1 ml de 0,25% Tripsina-EDTA para o córtex em tampão dissecção, elevando o volume final de 2 ml de tripsina e concentração final de 0,125%. Colocar o tubo de 15 ml em um banho de água 37 ° C por 8 minutos. Durante este tempo, o fogo polonês 3 pipetas de vidro Pasteur, formando aberturas sucessivamente menores, em um armário de biossegurança para ajudar a manter a esterilidade. Após a incubação 8 minutos do córtex, adicione 10 ml de DMEM contendo 10% FBS para o córtex para ajudar a parar a reação de tripsina. Centrifugar o tubo contendo 15 ml do córtex e DMEM/10% FBS a 2500 rpm por 2 minutos. No armário de biossegurança, remover o sobrenadante do córtex usando um copo pipeta Pasteur com sucção a vácuo em anexo. Tenha cuidado para não perturbar ou deslocar o pellet. Adicionar 1 ml da NMB ao pellet córtex e gentilmente pipeta cima e para baixo. É muito importante para evitar a criação de bolhas de ar enquanto pipetagem cima e para baixo, como as bolhas de ar podem danificar as células por oxidação. Use o fogo-polido pipeta Pasteur com a mais ampla abertura para triturar o córtex, anexando um bulbo de borracha estéreis até o fim e pipetagem cima e para baixo 5 vezes, novamente tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Continue esse processo com as outras duas pipetas de vidro, cada uma com um tamanho de abertura diminuiu. Após a trituração, centrifugação as células novamente a 2500 rpm por 2 minutos. Após a centrifugação, uma vez remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 2 ml de NBM. Filtrar a solução de células ressuspenso através de um filtro de células 45 um. Mancha as células com Trypan Blue, contados, e carregado no dispositivos. Normalmente, carga de 20 ul de células por dispositivo. Nota: a concentração final de células é tipicamente entre 2,5 milhões de células / ml e 8 milhões de células / ml Carregando as células Depois que as células foram contadas, é hora de carregar as pilhas no dispositivo: Traga os dispositivos previamente preparado contendo NBM para a cabine de segurança biológica para manter a esterilidade. Retire o excesso de mídia dos poços por sucção a vácuo. No entanto, ter cuidado para evitar a remoção de todos os meios de comunicação – deve haver alguns meios de comunicação no canal principal. Aplicar 20 ul de células para o reservatório superior esquerdo do dispositivo (veja o diagrama se necessário). O fluxo de células dentro do dispositivo e anexar à superfície PLL tratada. Depois de carregar, colocar os dispositivos contendo células de volta em uma incubadora por 10 minutos para permitir que as células para anexar. Após 10 minutos, preencher os reservatórios com a mídia e dispositivos lugar de volta na incubadora.