Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

Vorbereitung E18 Fetal Rat kortikalen Neuronen für Kompartimentierung Vor dem Losfahren ist es wichtig, alle notwendigen Medien und Reagenzien auf 37 ° C warmen Es ist auch wichtig, dass alles, was für die Vorbereitung der Zellen (z. B. Gummi Glühbirnen, Reagenzglasgestelle, Medien-Flaschen, etc.), und das, was in der Motorhaube platziert ist, durch Abwischen mit 70% Ethanol verwendet wird sterilisieren. Legen Sie zwei Stück E18 Fetal Rat Cortex (ein Gehirn, vorher zerlegt) in einem 15 ml Röhrchen mit 1 ml eiskaltem Calcium-freien Magnesium-freie Präparation Puffer. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA auf die Hirnrinde in Dissektion Puffer, wodurch die endgültige Volumen auf 2 ml und letzte Trypsin-Konzentration auf 0,125%. Legen Sie die 15 ml Tube in einem 37 ° C Wasserbad für 8 Minuten. Während dieser Zeit bildet Feuer polish 3 Glas Pasteur Pipetten, immer kleinere Öffnungen, in einem Biosicherheitswerkbank zu helfen, der Aufrechterhaltung der Sterilität. Nach dem 8 Minuten Inkubation des Kortex, 10 ml DMEM mit 10% FBS auf die Großhirnrinde zu helfen, die Trypsin-Reaktion. Zentrifugieren Sie die 15 ml Tube mit der Rinde und DMEM/10% FBS bei 2500 rpm für 2 Minuten. In der Biosicherheitswerkbank, entfernen Sie den Überstand aus der Rinde mit einem Glas Pasteur-Pipette mit Vakuum angesaugt. Achten Sie darauf, nicht zu stören oder zu vertreiben die Pellets. 1 ml der NMB zum Kortex Pellet und sanft Pipette auf und ab. Es ist sehr wichtig, damit Sie keine Luftblasen während Pipettieren auf und ab, wie die Luftblasen können die Zellen durch Oxidation beschädigt. Verwenden Sie die feuerpolierte Pasteur-Pipette mit dem breitesten Öffnung der Hirnrinde durch die Anbringung eines sterilen Gummiball bis zum Ende und Pipettieren nach oben und unten 5 Mal verreiben, wieder darauf achten, daß einführen Luftblasen. Setzen Sie diesen Vorgang mit den anderen 2 Glas Pipetten, jeweils mit einer verringerten Öffnung Größe. Nach Anreiben Zentrifuge bis die Zellen wieder bei 2500 rpm für 2 Minuten. Nach der Zentrifugation erneut den Überstand und Zellpellet in 2 ml NBM. Filter der resuspendierten Zellen-Lösung durch ein 45 um Zellsieb. Stain die Zellen mit Trypanblau, gezählt und geladen in die Geräte. Wir laden normalerweise 20 ul der Zellen pro Gerät. Hinweis: Die Endkonzentration der Zellen ist in der Regel zwischen 2,5 Mio. Zellen / ml und 8 Millionen Zellen / ml Das Laden der Zellen Nachdem die Zellen gezählt wurden, ist es Zeit, um die Zellen in das Gerät zu laden: Bringen Sie die zuvor hergestellte Geräte mit NBM in die Biosicherheitswerkbank, um die Sterilität zu erhalten. Entfernen Sie überschüssige Medien aus den Vertiefungen durch Vakuum abgesaugt. Seien Sie jedoch vorsichtig, um zu vermeiden Entfernen aller der Medien – es muss einige Medien in den Hauptkanal werden. Übernehmen 20 ul der Zellen auf der oberen linken Reservoir des Gerätes (siehe Diagramm falls erforderlich). Die Zellen fließen in das Gerät und befestigen Sie die PLL behandelten Oberfläche. Nach dem Laden, setzen Sie die Geräte mit mehreren Zellen wieder in einen Inkubator für 10 Minuten, damit sich die Zellen zu verbinden. Nach 10 Minuten füllen die Stauseen mit Medien und Geräten Platz zurück in den Inkubator.