إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك
Summary
في هذا الفيديو نظهر إعداد E18 العصبونات القشرية الجرذ.
Abstract
في هذا الفيديو ، ونبدي استعدادا للE18 الخلايا العصبية الفئران القشرية. ويتم الحصول على الخلايا العصبية الفئران E18 E18 القشرية من القشرة تشريح الفئران الجنينية وأعدت مسبقا. القشرة E18 هو ، على تشريح ، فصلها فورا في الخلايا العصبية الفردية. فمن الممكن لتخزين E18 في القشرة العازلة E إسبات B27 تحتوي على 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل تنفيذ الانفصال. ومع ذلك ، سيكون هناك انخفاض في بقاء الخلية. عادة نحن لدينا الحصول على E18 جديدة اللحاء. ينقل إلى المختبر في البرد الثلج الكالسيوم المغنيسيوم العازلة تشريح حرة حرة (CMFM). لدى وصوله ، يضاف إلى التربسين القشرة إلى التركيز النهائي 0.125 ٪. ومن ثم حضنت القشرة عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. يضاف DMEM FBS تحتوي على 10 ٪ في القشرة لوقف التفاعل. ثم يتم طرد القشرة عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تتم إزالة طاف و 2 مل من وسائل الإعلام بصل العصبية (NBM) التي تحتوي على 2 ٪ B27 (المجلد / المجلد) و 0.25 ٪ يضاف Glutamax (المجلد / المجلد) إلى القشرة التي هي ثم إعادة علقتها pipetting صعودا وهبوطا. المقبل ، هو مسحوق القشرة مع ماصات النار سابقا الزجاج المصقول ، مع كل افتتاح المتعاقبة أصغر. بعد الطحن ، يتم طرد مرة أخرى القشرة في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تتم إزالة ثم طاف بيليه والقشرة إعادة العالقة مع 2 مل من NBM تحتوي B27 وGlutamax. ثم يتم تمرير تعليق الخلية من خلال 40 مصفاة أم النايلون الخلية. المقبل يتم الاعتماد على الخلايا. الخلايا العصبية هي الآن جاهزة للتحميل في الجهاز ميكروفلويديك الخلايا العصبية.
Protocol
Discussion
يمكن أن تختلف تبعا لكثافة خلية التطبيق. ومع ذلك ، زرع الخلايا العصبية الأولية في منخفض جدا من كثافة يؤدي عادة إلى موت الخلية. اعتمادا على الحاضنة ومستوى الرطوبة ، وسائل الإعلام قد تحتاج إلى تغيير في الأجهزة كل يوم 2 إلى 3. عند تغيير وسائل الإعلام ، فمن المهم بعد إزالة وسائل الإعلام من الخزانات ، وأبدا لإزالة وسائل الاعلام من القنوات الرئيسية. علاوة على ذلك ، هو ممارسة جيدة لوضع وسائل الإعلام الجديدة في الآبار أعلى والسماح لبعض وسائل الإعلام الجديدة في التدفق من خلال الجهاز والى القنوات الرئيسية قبل ملء جميع الخزانات.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
| CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
| 15 ml Tube | Tool | BD Falcon | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
| 37˚C water bath | ||||
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
| DMEM | medium | Invitrogen | ||
| FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
| centrifuge | set at 2500 rpm | |||
| Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
| BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Falcon | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
