Preparazione E18 neuroni corticali di ratto per compartimentazione in un dispositivo a microfluidi

Preparazione E18 neuroni corticali di ratto fetale per compartimentazione Prima di partire, è importante per scaldare tutti i supporti necessari e reagenti a 37 ° C. E 'anche importante per sterilizzare tutto ciò che viene utilizzato per la preparazione delle cellule (ad esempio, le lampadine gomma, portaprovette, bottiglie media, ecc), e ciò che è posto nel cofano, con l'annientamento verso il basso con il 70% di etanolo. Mettere due pezzi di corteccia di ratto E18 fetale (un cervello, precedentemente sezionato) in una provetta da 15 ml contenente 1 ml ghiacciata calcio-magnesio libero senza buffer di dissezione. Aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA alla corteccia dissezione nel buffer, portando il volume finale a 2 ml e la concentrazione di tripsina finale a 0,125%. Posizionare il tubo di 15 ml in un bagno d'acqua a 37 ° C per 8 minuti. Durante questo periodo, il fuoco lucidare 3 pipette Pasteur di vetro, formando aperture sempre più piccoli, in un armadio di biosicurezza per aiutare a mantenere la sterilità. Dopo l'incubazione 8 minuti della corteccia, aggiungere 10 ml di DMEM contenente 10% FBS alla corteccia per aiutare a fermare la reazione tripsina. Centrifugare i 15 tubo ml contenente la corteccia e DMEM/10% FBS a 2500 rpm per 2 minuti. Nell'armadio biosicurezza, rimuovere il sopranatante della corteccia con una pipetta Pasteur in vetro sottovuoto con aspirazione allegato. Fare attenzione a non disturbare o rimuovere il pellet. Aggiungere 1 ml di NMB al pellet di corteccia e pipettare delicatamente su e giù. E 'molto importante evitare di creare bolle d'aria, mentre pipeting su e giù, come le bolle d'aria può danneggiare le cellule dall'ossidazione. Usare il fuoco lucido pipetta Pasteur con la più ampia apertura verso triturare la corteccia ed accompagnato da una lampadina sterile gomma fino alla fine e pipeting su e giù per 5 volte, sempre facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Continuare questo processo con gli altri 2 pipette di vetro, ciascuna con una dimensione di apertura ridotto. Dopo la triturazione, centrifuga giù le cellule di nuovo a 2500 rpm per 2 minuti. Dopo la centrifugazione, ancora una volta, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di NBM. Filtrare la soluzione risospeso cellula attraverso un colino 45 celle um. Macchia le cellule con Blu tripan, contati, e caricati nel dispositivo. Noi di solito carico 20 ul di cellule per dispositivo. Nota: la concentrazione finale di cellule è in genere tra 2,5 milioni di cellule / ml e 8 milioni di cellule / ml Caricamento in corso le cellule Dopo che le cellule sono state contate, è tempo di caricare le cellule del dispositivo: Portare i dispositivi precedentemente preparato contenente NBM nel mobile biosicurezza per mantenere la sterilità. Rimuovere i supporti in eccesso dai pozzi di aspirazione. Tuttavia, fare attenzione a evitare di rimuovere tutti i mezzi di comunicazione – ci deve essere qualche supporto nel canale principale. Applicare 20 ul di cellule al serbatoio in alto a sinistra del dispositivo (vedi schema se necessario). Il flusso di cellule nel dispositivo e attaccarsi alla superficie trattata PLL. Dopo il caricamento, posizionare i dispositivi contenenti cellule indietro in un incubatore per 10 minuti per consentire alle cellule di allegare. Dopo 10 minuti, riempire i serbatoi con i media e dispositivi di luogo indietro nell'incubatrice.