הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic
Summary
בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת E18 עכברוש נוירונים בקליפת המוח.
Abstract
בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת E18 נוירונים בקליפת המוח עכברוש. E18 נוירונים בקליפת המוח עכברוש מתקבלים קליפת E18 עכברוש העובר גזור בעבר מוכן. קליפת E18 הוא, על לנתיחה, ניתק מיד נוירונים בודדים. אפשר לאחסן E18 קליפת במאגר E שינה המכיל B27 על 4 מעלות צלזיוס עד שבוע לפני הניתוק מתבצע. עם זאת, תהיה ירידה כדאיות התא. בדרך כלל אנו מקבלים E18 שלנו Cortex טריים. זה מועבר למעבדה של סידן קרים כקרח חינם המאגר מגנזיום לנתיחה בחינם (CMFM). עם ההגעה, טריפסין מתווסף בקליפת לריכוז סופי של 0.125%. קליפת המוח היא מודגרות אז במשך 8 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. DMEM FBS המכיל 10% מתווסף בקליפת להפסיק את התגובה. קליפת המוח היא centrifuged אז בסל"ד 2500 למשך 2 דקות. Supernatant יוסר 2 מ"ל של מדיה בסל עצבית (NBM) המכיל 2% B27 (כרך / כרך א) ו – 0.25% Glutamax (כרך / כרך) נוסף בקליפת המוח אשר מחדש הושעה על ידי pipetting למעלה ולמטה. בשלב הבא, בקליפת הוא triturated בעבר עם מלוטש אש pipettes זכוכית, כל אחד עם פתח קטן רצופים. לאחר triturating, בקליפת הוא centrifuged שוב ב 2500 סל"ד במשך 2 דקות. Supernatant מוסר אז גלולה קליפת מחדש מושעה עם 2 מ"ל של NBM המכיל B27 ו Glutamax. ההשעיה התא לאחר מכן עבר דרך מסננת 40 ניילון אממ התא. הבא התאים נספרים. הנוירונים מוכנים כעת לטעינה לתוך המכשיר נוירון microfluidic.
Protocol
Discussion
צפיפות תאים יכולים להיות מגוונים בהתאם ליישום. עם זאת, זריעת נוירונים העיקרי בבית נמוך מדי של צפיפות בדרך כלל מוביל מוות של תאים. בהתאם החממה ועל רמת לחות, מדיה ייתכן שיהיה צורך לשנות את המכשירים כל 2 עד 3 ימים. בעת שינוי התקשורת, חשוב לאחר הסרת התקשורת ממאגרים, מעולם לא להסיר את ערוצי התקשורת העיקריים. יתר על כן, זהו תרגול טוב למקום התקשורת טרי בארות העליון לאפשר כמה התקשורת טרי לזרום דרך המכשיר לתוך ערוצים עיקריים לפני ממלא את כל המאגרים.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
| CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
| 15 ml Tube | Tool | BD Falcon | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
| 37˚C water bath | ||||
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
| DMEM | medium | Invitrogen | ||
| FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
| centrifuge | set at 2500 rpm | |||
| Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
| BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Falcon | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
