הקרנת Assay עבור סטרס חמצוני בתוך הקו Cell חתולים Astrocyte, G355-5
Summary
שיטת ההקרנה לזהות סביבות הסלולר חמצוני היא למדוד את החמצון של CM-H2DCFDA. לאחר חמצון מן הלא למתחם ניאון ניאון בתוך, תא CM-H2DCFDA שינויים. שינוי זה של הקרינה נמדדת cytometry זרימה ומציין את מספר התאים בסביבה חמצוני.
Abstract
לעתים קרובות, הציע מנגנון של וירוס המושרה נזק עצבי הוא סטרס חמצוני. האסטרוציטים יש תפקיד חשוב בשליטה על סטרס חמצוני של מערכת העצבים המרכזית (CNS). האסטרוציטים לעזור לשמור על הסביבה homeostatic עבור נוירונים, כמו גם נוירונים להגנה מפני מינים החמצן מגיב (ROS). CM-H2DCFDA הוא אינדיקטור התא חדיר עבור נוכחות של ROS. CM-H 2 DCFDA נכנס לתא כמתחם לא ניאון, ואז הוא הופך ניאון לאחר esterases הסלולר להסיר את קבוצות אצטט, ואת מתחם מתחמצן. מספר תאים, נמדד על ידי cytometry זרימה, כי הם מצאו להיות fluorescing ירוק הוא אינדיקציה למספר התאים נמצאים במצב חמצוני. CM-H 2 DCFDA רגיש חמצון על ידי מספר גדול של ROS שונים. חוסר הספציפיות, שלגביו ROS יכול לחמצן CM-H 2 DCFDA, עושה את זה תרכובת עוצר ערך לשימוש בשלבים הראשונים של חקירת הפתוגנזה, כמו זו assay יכול לשמש מסך עבור הסביבה הסלולרית חמצוני ללא תלות חמצן רדיקלי או שילוב של ROS אחראים התנאים הסלולר. ברגע שזה נקבע כי ROS נוכחים ידי חמצון של CM-H 2 DCFDA, אז ניסויים נוספים ניתן לבצע כדי לקבוע אילו ROS או שילוב של רוס מעורבים בתהליך הפתוגנזה בפרט. תוצאות המחקר הזה מראים כי עם תוספת של חמצן עלייה CM-H 2 DCFDA לזרוח זוהה יחסית שולטת מלוחים, המציין כי assay זה מבחן חשוב לאיתור סביבה חמצוני בתוך G355-5 תאים, חתולים תא astrocyte קו.
Protocol
1. Cell תרבות של האסטרוציטים חתולים ולטיפול עם H 2 O 2 תא התרבות קו G355-5 ב בקבוקון 75 ס"מ 2 עם התקשורת DMEM בתוספת חומרים מזינים ב 37 ° C ו 5% CO 2 ומחוברות עד 60% (~ 5 ימים). החלף את המדיה כל 1-2 ימים או לפי הצורך לש…
Discussion
המנגנון המוצע לעתים קרובות של הנגיף המושרה נזק עצבי הוא סטרס חמצוני 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. בעיקרון, מוצע כי באמצעות חשיפה ויראלי גליה (האסטרוציטים ו microglia) לשחרר רדיקלים תגובתי כגון, הידרוקסיד, אניון superoxide, תחמוצת החנקן, ו / או מי חמצן, שהם רעילים לנוירונים. באופן ד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מוצרים ReadiSorb על תמיכתם הנדיבה של מחקרים אלה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
- Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease. J Exp Med. 181, 735-745 (1995).
- Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice. Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).
- Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).
- Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. Glia: the not so innocent bystanders. J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).
- Cooper, A. J., Kristal, B. S. Multiple roles of glutathione in the central nervous system. Biol Chem. 378, 793-802 (1997).
- Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress. J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).
- Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).
- Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity. J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).
- Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M. Neuropathogenesis of AIDS. Mol Med Today. 2, 16-23 (1996).
- Dringen, R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).
- Dringen, R., Hamprecht, B. Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells. Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).
- Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione. J Neurosci. 19, 562-569 (1999).
- Everall, I. P. H. u. d. s. o. n., L, R. W. K. e. r. w. i. n. Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome. Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).
- Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).
- Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. An experimental model system for HIV-1-induced brain injury. Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).
- Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus. Neuroscience. 53, 1-6 (1993).
- Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals. Brain Res. , 677-6345 (1995).
- Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain. J Exp Med. 182, 941-951 (1995).
- Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures. Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).
- Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro. J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).
- Lipton, S. A. Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species. Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).
- Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide. Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).
- Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).
- Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes. Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).
- Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. 2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation. FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).
- Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. Glutathione efflux from cultured astrocytes. J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).
- Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules. Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).
- Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 270, 296-299 (1995).
- Wang, X. F., Cynader, M. S. Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione. J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).
- Wilson, J. X. Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes. Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).
- Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia. Glia. 13, 92-100 (1995).
Cite This Article
Testa, M. P., Alvarado, O., Wournell, A., Lee, J., Guilford, F. T., Henriksen, S. H., Phillips, T. R. Screening Assay for Oxidative Stress in a Feline Astrocyte Cell Line, G355-5. J. Vis. Exp. (53), e2841, doi:10.3791/2841 (2011).