Ensayo de detección de estrés oxidativo en una línea celular astrocitos felina, G355-5
Summary
Un método de cribado para detectar la oxidación celular entornos es medir la oxidación de la CM-H2DCFDA. Una vez oxidado dentro de una célula, CM-H2DCFDA cambios no fluorescentes en un compuesto fluorescente. Este cambio en la fluorescencia se mide mediante citometría de flujo e indica el número de células en un ambiente oxidativo.
Abstract
Un mecanismo frecuentemente sugerido inducida por el virus de daño neuronal es el estrés oxidativo. Los astrocitos tienen un papel importante en el control de estrés oxidativo del Sistema Nervioso Central (SNC). Los astrocitos ayudan a mantener un medio homeostático de las neuronas, así como la protección de las neuronas a partir de especies reactivas del oxígeno (ROS). CM-H2DCFDA es un indicador penetran en las células de la presencia de ROS. CM-H 2 DCFDA entra en la célula como un compuesto no fluorescente, y se convierte en fluorescente después de esterasas celulares eliminar los grupos de acetato, y el compuesto se oxida. El número de células, medido por citometría de flujo, que se encuentran para ser fluorescente verde es una indicación de la cantidad de células que se encuentran en un estado de oxidación. CM-H 2 DCFDA es susceptible a la oxidación por un gran número de diferentes ROS. Esta falta de especificidad, respecto de los cuales ROS puede oxidar CM-H 2 DCFDA, hace que este compuesto un regente valiosa para su uso en las primeras etapas de una investigación de la patogénesis, ya que este ensayo puede ser utilizado para la detección de un ambiente oxidativo celular, independientemente de que el oxígeno radical o una combinación de ROS son los responsables de las condiciones celulares. Una vez que se ha establecido que las ROS se presentan por la oxidación de la CM-H 2 DCFDA, entonces experimentos adicionales se puede realizar para determinar qué combinación de ROS o ROS están implicados en el proceso de patogénesis particular. Los resultados de este estudio demuestran que con la adición de peróxido de hidrógeno un aumento de la CM-H 2 DCFDA fluorescencia se detectó en relación con los controles de solución salina, lo que indica que este ensayo es una prueba muy útil para la detección de un ambiente oxidativo en las células G355-5, un la línea celular de astrocitos felino.
Protocol
Discussion
A menudo se sugiere un mecanismo de daño neuronal inducido por el virus es el estrés oxidativo 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Básicamente, se propone que a través de la exposición al virus de la glía (astrocitos y microglia) liberar los radicales de oxígeno reactivo, tal como hidróxido, el anión superóxido, óxido nítrico y / o peróxido de hidrógeno, que son tóxicos para las neuronas. Del mismo modo, el estrés oxidativo también ha sido sugerido como un importante mecanismo patológico …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a los productos ReadiSorb por su generoso apoyo de estos estudios.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
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